清酱肉体外模拟消化后粗肽的抗氧化活性和氨基酸分析

王 乐，李 享，刘文营，贾晓云，曲 超，成晓瑜，赵 冰

（中国肉类食品综合研究中心 北京食品科学研究院 国家肉类加工工程技术研究中心肉类加工技术北京市重点实验室 北京100068）

清酱肉一般具有色泽鲜明，清香微腻，香味浓郁，风味独特等特点，有一定的研究价值[1]。肉类通常是当今消费者摄取高品质蛋白质以及必需氨基酸的主要来源之一[2]。据报道[3]，可从肉或肉制品提取出具有生物活性的物质，如抗氧化肽。肉类中的生物活性肽可以通过水解、消化或在加工过程（发酵、成熟）中产生[4-6]。大量研究证明，肽的抗氧化性很大程度上取决于分子质量大小，氨基酸构成和肽的序列等因素[7-8]。Xing 等[9]从宣威火腿中分离纯化得到抗氧化肽，经质谱鉴定序列为Asp-Leu-Glu-Glu 的四肽表现出更强的抗氧化能力。Sun等[10]从广式腊肠中提取的多肽液具有较高的DPPH·清除能力。刘芝君等[11]发现动物蛋白复合酶酶解四川腊肉得到的产物具有较好的抗氧化效果。

通常与干腌肉制品中抗氧化肽相关的研究一般用盐酸或磷酸作为提取液，测定所提多肽的含量及其抗氧化能力[12]。肉类一般不直接食用，通常需要先经过加热烹饪，在人体内消化后才可吸收其营养成分或发挥生物功能[13-15]。然而，在胃、肠道的消化过程中，消化酶、极端pH 值、无机盐及其它条件可能会对蛋白质和多肽的结构或活性产生一定的影响[16]。甚至有研究报道：食源性短肽服用之后，易于被胃、肠道消化酶降解而丧失其本来的生物功能[17]。由消化酶水解食源性蛋白所制备的短肽则具有较好的抗消化酶降解能力，与相同组成的游离氨基酸比较更容易被机体所吸收[18]。陈晨等[19]研究发现米发糕经胃、肠消化后蛋白质充分降解，从而增加了更多具有抗氧化能力的基团暴露在胃、肠道中的可能性。与化学提取法对比，通过体外模拟胃、肠消化清酱肉所得粗肽能更好地反映和模拟其在生理条件下的生物活性表现。

目前虽然有从干腌肉制品中提取天然抗氧化肽的报道，但是大部分集中在从火腿中提取具有生物活性的肽，针对从腊肉中提取抗氧化肽的研究比较少[20-21]。尤其是目前关于模拟胃、肠道消化，从腊肉中提取粗肽并对其抗氧化性的研究鲜见报道。本文以清酱肉为原料，模拟胃、肠道消化提取粗肽，通过DPPH·清除能力、ABTS+·清除能力、总抗氧化能力（FRAP）、Fe2+螯合能力和还原能力等主要指标评价其抗氧化能力，并对酶解粗肽进行氨基酸分析，探索清酱肉在胃、肠道环境下的抗氧化活性和粗肽的生物有效性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

猪五花肉，北京二商大红门肉类食品有限公司；加工辅料，中国肉类食品综合研究中心香辛料部。

DPPH、邻二氮菲，美国Sigma 公司；铁氰化钾（K3[Fe（CN）6]）、三氯乙酸（TCA），国药集团化学试剂有限公司；ABTS 抗氧化能力检测试剂盒、总抗氧化能力检测试剂盒（FRAP 法），上海碧云天生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

ME104 分析天平，瑞士Mettler-Toledo 公司；Milli-Q Reference 超纯水系统，美国Millipore 公司；Evolution 220 紫外-可见分光光度计，美国赛默飞世尔科技公司；SYNERGY H4 酶标仪，美国伯腾仪器有限公司；日立L-8900 氨基酸分析仪，日本日立公司；D-500 匀浆机，德国WIGGENS 公司；Sorvall LYNX-4000 型离心机，美国赛默飞世尔科技公司；LGJ-30D 冷冻干燥机，北京四环科学仪器厂有限公司；

1.3 方法

1.3.1 清酱肉的加工工艺 根据王乐等[6]的方法，以猪五花肉为原料制作清酱肉，共重复3 批次。

1.3.2 体外模拟消化清酱肉提取粗肽 参考Simonetti 等[22]的方法模拟胃、肠消化。将五花肉和清酱肉剔掉脂肪，分别将瘦肉绞碎后装入袋中，75℃水浴煮30 min。取煮后样品30 g，加入250 mL去离子水，低速均质1 min，用1 mol/L HCl 溶液调节匀浆液pH 值至2.0，按照酶∶底物（m/m）为1∶100 的比例加入胃蛋白酶，混匀后37 ℃恒温摇床中振荡2 h，用1 mol/L NaHCO3溶液将酶解液pH值调至7.2，终止反应。按照酶∶底物（m/m）为1∶50的比例添加胰酶，混匀后于37 ℃恒温摇床中振荡3 h，反应结束后在95 ℃水浴中保持10 min 使酶失活。冷却后10 000×g 离心20 min，抽滤上清液后冷冻干燥，即清酱肉经模拟胃、肠消化所得粗肽样品和五花肉经模拟消化所得粗肽样品。

1.3.3 DPPH·清除测定 参考Wang 等[23]的方法，分别将模拟胃、肠消化后所提取的清酱肉粗肽和五花肉粗肽配成质量浓度分别为1，2，3，4，5 mg/mL 的粗肽液，将0.2 mmol/L DPPH·溶液（95%乙醇）和粗肽液以体积比1∶1 混合均匀，室温避光放置30 min 后测517 nm 处的吸光度，记样品管。对照管为0.2 mmol/L DPPH·溶液（95%乙醇）与去离子水按体积比1∶1 混合，空白管为样品液与95%乙醇按体积比1∶1 混合。DPPH·清除率计算如下：

1.3.4 Fe2+螯合能力的测定 参考Lee 等[24]的方法，分别将模拟胃、肠消化后所提取的清酱肉粗肽和五花肉粗肽配成质量浓度分别为1，2，3，4，5 mg/mL 的粗肽液。将1 mL 粗肽液与0.05 mL FeCl2（2 mmol/L）混合，振荡混匀后加入0.2 mL 菲洛嗪（5 mmol/L）启动反应，剧烈混匀，静置10 min后测定其在波长562 nm 处的吸光度。计算Fe2+螯合率。

式中：A样品——样品组所测吸光度值；A空白——去离子水代替样品所测吸光度值。

1.3.5 还原力的测定 参考蔡俊等[25]的方法，分别将模拟胃、肠消化后所提取的清酱肉粗肽和五花肉粗肽配成质量浓度分别为1，2，3，4，5 mg/mL的粗肽液。将1 mL 粗肽液加入2 mL 0.2 mol/L 磷酸缓冲液（pH 6.6）中，与2 mL 1 g/100 mL K3[Fe（CN）6]溶液混合，振荡均匀，在50 ℃水浴中反应20 min，快速冷却。加入2 mL TCA（10 g/100 mL），充分混匀，4 000 r/min 离心10 min。取2 mL 上清液，加2 mL 去离子水和0.4 mL FeCl3溶液（0.1 g/100 mL），振荡混匀后放置10 min，之后测定A700nm。

1.3.6 ABTS＋·清除能力测定 根据ABTS 抗氧化能力检测试剂盒方法测定、计算，结果用单位质量（g）的肽等同于trolox 物质的量（TEAC）表示，单位为mmol Trolox/g。

1.3.7 总抗氧化能力（FRAP）的测定 按照试剂盒方法，于波长593 nm 处测定吸光度。用试剂盒提供的FeSO4·7H2O 配制不同浓度的FeSO4·标准溶液，绘制标准曲线，结果以每克肽相当于FeSO4的物质的量表示，单位为mmol FeSO4/g。

1.3.8 总氨基酸组成分析 将清酱肉粗肽粉溶解，置于装有15 mL 6 mol/L HCl 的水解玻璃管中，抽真空，充入氮气，重复3 次后封口，于110 ℃水解22 h，冷却后过滤，定容50 mL。将1 mL 滤液加入试管中蒸发至干，之后用1 mL 柠檬酸钠缓冲液（pH 2.2）复溶，摇匀，用0.22 μm 微孔滤膜过滤，以备上机分析。

1.3.9 游离氨基酸组成分析 参考Mirae 等[26]的方法，将一定量清酱肉粗肽粉溶解于20 mL 去离子水中，加入20 mL 10%磺基水杨酸，振荡均匀，4℃反应15 h，使大分子蛋白质沉淀，之后4 ℃离心（12 000×g，20 min），取上清液，过0.22 μm 微孔滤膜，以备上机分析。

1.4 数据处理

所有指标均重复测定3 次，结果用平均值±标准差表示。利用Excel 软件处理数据，用Origin 8.0 软件作图。采用SPSS 22.0 软件分析方法中的Duncan’s 多重比较做数据的显著性分析。

2 结果与分析

2.1 DPPH·的清除效果

DPPH·清除法是常用的抗氧化性评价方法[27]。由图1 可知，模拟消化后，五花肉与清酱肉粗肽液都表现出一定的DPPH·清除能力。当清酱肉粗肽质量浓度为1～3 mg/mL 时，随着浓度的升高，清除率逐渐增强；当清酱肉粗肽质量浓度大于3 mg/mL 时，DPPH·清除率变化缓慢；当清酱肉粗肽质量浓度为3 mg/mL 时，清酱肉粗肽液对DPPH·的清除率达81.41%，显著高于同浓度的五花肉粗肽（P ＜0.05）。Zhu 等[28]用胃蛋白酶和胰蛋白酶消化金华火腿，所得产物质量浓度为3 mg/mL 时，其DPPH·清除率为57.50%。

DPPH·清除活性可能与疏水性氨基酸含量相关。据报道蛋白酶解物具有较强的DPPH·清除能力，与其所含较多的疏水性氨基酸或肽有关[21，29]。从清除DPPH·方面考虑，推测模拟胃、肠消化后清酱肉粗肽中可能包含一些由疏水性氨基酸组成的肽段。

2.2 Fe2+螯合能力

机体内的很多氧化反应都需要过渡金属离子的催化，如Fe2+催化巯基化合物的自氧化，促使自由基的形成（如氧自由基和羟自由基），进而产生破坏人体健康和食品组分的物质[30]。螯合Fe2+能力大小常用来评价样品抗氧化的能力。

由图2 可知，模拟消化后，随着粗肽浓度的升高，五花肉粗肽液和清酱肉粗肽液的螯合Fe2+的能力均呈上升趋势。清酱肉粗肽的Fe2+螯合能力从质量浓度为1 mg/mL 时的7.47%增至质量浓度5 mg/mL 时的30.45%，显著高于五花肉粗肽（P＜0.05）。有研究发现短肽中暴露的中性和酸性氨基酸因其含有的游离羧基与Fe2+形成螯合物，而减少机体自由基的形成[31-32]。清酱肉粗肽较高的Fe2+螯合能力可能和酶解物包含较多可与Fe2+螯合的中性和酸性氨基酸肽段相关。

图1 清酱肉粗肽液和五花肉粗肽液对DPPH·的清除效果Fig.1 DPPH free radicals scavenging effect of the crude peptides extract from pickled sauced meat and pork belly

图2 清酱肉粗肽液和五花肉粗肽液对Fe2+的螯合率Fig.2 Fe2+ chelating effect of the crude peptides extract from pickled sauced meat and pork belly

2.3 还原能力

还原力在一定程度上可以表示抗氧化剂提供电子的能力。据报道，抗氧化能力和还原力呈正相关[33]。如图3所示，模拟消化后，清酱肉粗肽的还原力随浓度的上升而逐渐提高，在其质量浓度5 mg/mL 时还原力的吸光度值最大，是五花肉粗肽的3.26 倍，且始终显著高于五花肉粗肽（P＜0.05），这说明清酱肉粗肽的抗氧化能力随浓度的上升而增强。刘文颖等[34]指出粗肽的还原能力可能是部分具有供氢能力的氨基酸残基引起的。樊梓鸾等[13]发现消化酶可以促进抗氧化活性物质的释放，胃、肠消化后使样品形成更多的小肽和氨基酸等物质，因此模拟消化后清酱肉粗肽有更优的抗氧化活性。

2.4 ABTS＋·清除能力

ABTS＋·清除能力也常被用作考察样品的抗氧化能力[35]。如图4 可知，相对于五花肉粗肽，清酱肉粗肽的抗氧化性更高，差异性显著。这与具有抗氧化能力的肽链长度一般较短有关，而清酱肉加工过程中由于内源酶的存在会发生降解，生成丰富的多肽和小肽，因此清酱肉粗肽的ABTS＋·清除率较高（0.337 mmol Trolox/g）。Gallego 等[8]用胃蛋白酶和胰蛋白酶消化干腌火腿副产物所得粗肽的ABTS＋·清除活性为0.220 mmol Trolox/g。这可能是因为模拟胃、肠消化能够促进蛋白质降解为小肽或游离氨基酸，极性基团含量增加，从而使亲水性提高[36]。

2.5 总抗氧化能力（FRAP）

FRAP 法反映的不是样品针对某一种自由基的清除能力，因此常用来评价样品的总抗氧化活性[37]。由图4 可知，模拟消化后，五花肉粗肽和清酱肉粗肽均具有一定的FRAP 能力。清酱肉粗肽的FRAP 为0.121 mmol FeSO4/g，是五花肉粗肽的3.44 倍。据Ahhmed 等[38]报道肠胃、模拟消化过程中强烈的蛋白水解会促使许多具有生物活性的低分子质量肽生成。这可能是因为清酱肉模拟消化后进一步降解的低分子质量多肽组分是很好的氢或电子供应体，具有较好的总抗氧化能力。

图3 清酱肉粗肽液和五花肉粗肽液的还原力Fig.3 The reduction ability of the crude peptides extract from pickled sauced meat and pork belly

图4 清酱肉粗肽液和五花肉粗肽液的ABTS＋·清除能力和总抗氧化能力（FRAP）Fig.4 The ABTS＋· scavenging capacity and FRAP of the crude peptides extract from pickled sauced meat and pork belly

2.6 氨基酸分析

一般来说，肽的生物活性与氨基酸组成、序列和疏水性等密切相关[39]。据报道，肽段中含有的酸性氨基酸（天冬氨酸和谷氨酸）和碱性氨基酸（组氨酸、精氨酸、赖氨酸）使抗氧化肽具有较强的金属离子螯合能力和自由基清除活性[40]。此外，肽链中含有疏水性氨基酸（如Tyr、Ala、Met、Val、Phe、Ile、Leu 和Pro）往往具有较高的抗氧化活性[41]。黄湛媛等[42]发现Gly-Asn-Gly-Leu-Pro 的结构对自由基清除有重要影响。宣威火腿中序列为 Asp-Leu-Glu-Glu 肽被发现有良好的抗氧化性[9]。葛晓鸣等[39]发现海马酶解多肽中疏水性氨基酸Tyr、Met、Phe 对其抗氧化活性贡献较多，这也许是因为疏水性氨基酸作为供氢体，可与自由基反应增强粗肽的抗氧化能力，也可能是疏水性氨基酸更易于和金属离子螯合，或是由于具有疏水性能更好的存在于水-脂质界面处，从而提高多肽的自由基清除能力。由表1所示，经模拟消化，清酱肉最终产物组成中游离氨基酸占29.92%，表明有70%左右的最终消化产物是以肽的形式存在的，有利于吸收和表现抗氧化活性。清酱肉经模拟消化，粗肽中必需氨基酸含量占总氨基酸含量的39.47%，说明清酱肉经胃、肠酶消化所得粗肽仍有一定的营养价值。基于总氨基酸含量，粗肽中酸性氨基酸的占比为28.41%，碱性氨基酸的占比为25.21%，疏水性氨基酸的占比为36.04%。这3 种与抗氧化作用有关的氨基酸占总氨基酸含量的89.66%。

清酱肉经模拟胃、肠消化，粗肽中疏水性氨基酸含量较多，有助于促进疏水性较强的肽段的形成，因此具有较强的DPPH·清除效果。肽段中的疏水性氨基酸残基能够增强肽与食物中脂质的相互作用，通过和膜脂双层发生疏水作用促使抗氧化剂进入靶器官[43]。肽段所具有的较强的ABTS＋·清除活性可能和极性氨基酸（Asp、Glu 和His、Arg、Lys）相关。粗肽中包含一定量的酸性与中性氨基酸，其侧链包含的-NH2和-COOH 能够和Fe2+紧密结合，从而发挥抑制金属离子催化自由基生成的作用。综上，清酱肉经模拟消化后粗肽表现出较好的总抗氧化能力。结合氨基酸分析可推断模拟消化清酱肉后，粗肽的抗氧化活性和其氨基酸组成有关。基于肽的抗氧化性是由氨基酸组成、序列等因素共同决定，因此仍需对清酱肉经模、拟胃肠消化后所得粗肽的结构等信息进行分析和鉴定。

表1 清酱肉粗肽的氨基酸成分分析Table 1 Amino acid composition of the crude peptides extract from pickled sauced meat

3 结论

本文通过体外模拟胃、肠消化清酱肉，以其原料五花肉为对照，清酱肉粗肽液的DPPH·清除能力、Fe2＋螯合能力和还原力随着浓度的增加而增加，显著高于五花肉粗肽。模拟消化后，清酱肉粗肽的总抗氧化能力（FRAP）是五花肉粗肽的3.44倍。模拟消化后，清酱肉最终产物组成中有70%左右是以肽的形式存在的，且与抗氧化作用有关的氨基酸占总氨基酸含量的89.66%。由氨基酸分析可知模拟消化后清酱肉粗肽的抗氧化活性与其氨基酸密切相关，同时具有一定的营养价值。体外模拟胃、肠消化促使肉类中生物活性肽的生成。与五花肉粗肽对比，清酱肉粗肽具有更强的抗氧化活性。