新型标志物血清外泌体miRNA在颅脑创伤诊断和监测预后的研究进展

徐新娟 王士洲 黄忻涛 闫青云 王 策

1.山西医科大学第一临床医学院，山西太原 030000；2.山西医科大学第一医院神经外科，山西太原 030000

颅脑创伤（traumatic brain injury，TBI）是指因各种外来因素直接或间接作用于头部,如交通事故、高处坠落、跌倒等，从而引起的一系列症状，包括脑震荡、脑出血、脑挫裂伤甚至脑疝形成。TBI 不仅在创伤外科中很常见，而且具有起病急，致残率、致死率高和预后不良等特点。格拉斯哥昏迷评分（Glasgow coma scale，GCS）、临床症状及影像学表现和格拉斯哥预后评分（Glasgow outcome scale，GOS）是TBI 患者损伤严重程度和预后的评估指标。虽部分轻度TBI 患者在没有任何医疗干预的情况下可以在损伤后的几周至几个月内康复，但仍有30%～53%个体会受到创伤的影响，甚至可能在损伤后至少1 年仍出现情绪、精神等症状[1]，目前这种现象被称之为“脑震荡后综合征”。因轻度TBI 患者的临床表现及影像学表现不典型，易出现误诊、漏诊等现象，虽是非致命性的，但会出现认知行为的改变进而影响患者日常生活及工作[2]。

美国路易斯安那州立大学DiGiorgio 等[3]在回顾性研究中，指出酒精和药物会干扰对于TBI 患者的GCS 评分结果，从而影响临床决策、疗效评估及预后分析。为提高对TBI 患者的即时诊断、精准预测预后、改善疾病转归，近年来出现了新的研究思路，即通过测定血清中外泌体（exosome，EXO）微小RNA（miRNA）的含量，来诊断评估疾病的严重程度、预测转归、监测疾病进展。

1 TBI 的流行病学特点及目前现状

TBI 是全球性的公共卫生问题，是死亡率和残疾率高的主要原因之一。Prins 等[4]调查研究显示，在美国TBI 的发病率为（200～558）/10 万。TBI 资料库的统计结果显示，47 所医院中约有13 000 多例TBI 住院患者，其中重度TBI 患者死亡率＞20%、严重致残率＞50%[5]。

TBI 治疗的关键是防治继发性的级联损伤，以重度与极重度TBI 患者为主。在脑疝发生以前行有效的手术治疗，可有效降低病死率、缓减致残率[6]。近年来，随着各项科研成果的临床应用及相关共识、指南等颁布实施，诊治疗效逐步提高，但是对于重型TBI 患者的及时诊断仍存在差异，寻找明确的生物标志物定量预测脑组织的损伤程度及监测病情，已成为神经外科医师进一步研究的方向。

2 TBI 后的病理生理变化

TBI 患者早期以急性损伤为主，后期表现为慢性退行性症状，如认知功能、运动功能障碍，伴随抑郁、焦虑等情绪变化。脑损伤后局部脑组织和神经元细胞经历缺血缺氧、氧化应激反应、炎症反应、细胞凋亡和组织坏死等多种病理变化过程，这些因素及其潜在的分子机制形成了一个复杂而有序的网络，贯穿于TBI的整个过程。炎症反应和血管新生是造成TBI 患者继发性级联损伤的关键，神经胶质细胞是神经炎症和神经元损伤的核心细胞[2]。神经炎症反应包括神经胶质细胞的启动，外周免疫细胞的募集和炎症介质的释放，这些反应不仅诱发继发性脑损伤，而且影响组织修复。

局部脑组织损伤后，不仅释放大量炎症介质，导致血管通透性增加，破坏血脑屏障，还引起弥漫性脑损伤，脑水肿，神经元凋亡、坏死，导致神经功能减退[7]。

3 EXO 的生理学特点及其形成

EXO 是由肥大细胞、神经细胞、B 细胞等多种细胞分泌释放的直径为30～150 nm 的纳米级磷脂双层膜包裹的囊泡[8]。外泌体通过在原细胞和靶细胞之间传递蛋白质、脂质和基因组分子（如DNA、miRNA、siRNA 等）来介导细胞间的通讯，在不同细胞之间的通讯中起着至关重要的作用。脂质双层结构保护其内容物免于降解，可存储于几乎所有体液中[9]，包括血液、尿液、唾液、脑脊液等，具有反映亲代细胞微环境的重要信息，作为非侵入性早期诊断的潜在生物标志物，引起研究者越来越多的关注。

EXO 潜在的临床价值归因于其低免疫原性、半衰期长和可穿透血脑屏障。外泌体的发现最早可追溯于20 世纪80 年代，由Pan 等[10]将网织红细胞用转铁蛋白受体标记并培养以观察转铁蛋白受体的作用，发现被标记受体被原细胞吞饮，然后以囊泡形式所释放。这些囊泡最初被认为是细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）。后来，Pan 等[10]称其为“外泌体”。

EXO 的形成过程：原细胞质膜内陷吞噬自身细胞内的遗传物质（mRNA、miRNA、DNA、蛋白等）形成早期膜内体，早期膜内体成熟后形成晚期膜内体，并通过微粒体膜内陷脱落形成多囊泡体（multivesicular bodies，MVB），MVB 与细胞质膜结合并将其释放到细胞外，从而形成EXO。EXO 携带有原细胞的遗传物质和调节蛋白，靶向作用于受体细胞，可改变受体细胞的表征[11]。

过去，人们一致认为EXO 是细胞碎片，细胞代谢物的处理场所。后来，有研究者发现，EXO 具备免疫调节、抑制炎症反应的功能。自此，研究者们开始提出大量有关EXO 及其内容物的课题想法，并且发现EXO 不仅在正常生理过程中，如免疫调节反应、细胞增殖及神经元的功能中发挥着不可替代的作用，而且在疾病病理变化的不同阶段，如神经退行性疾病和肿瘤相关疾病中行使其作用。EXO 是由不同细胞所产生的，在临床中，是极其重要的确诊和治疗方式。目前，研究者们已开发出多种方法来分离、提纯EXO 亚基，并且多项研究已显示EXO 中不同亚基组合可在同种细胞中执行不同的任务[8,12]。

4 TBI 患者体内EXO miRNA 的变化

EXO 中包含有多种RNA，其中mRNA、miRNA 是最丰富的物种，存在于EXO 的内部。外泌体释放的miRNA 不仅反应原细胞生物学功能，而且作用于下游靶基因，调控受体细胞的病理生理学功能。

miRNA 是由20～25 个核苷酸组成的小的非编码单链核酸分子，称为microRNA，通过与靶基因的mRNA 3’端的非编码区结构域相结合而在转录后调节基因表达，参与调控几乎所有生物学过程。

TBI 后损伤组织会经历一系列的病理生理变化，且在许多病理条件（如缺血缺氧、炎症、应激反应、肿瘤细胞增殖、转移等）下，血清中EXO miRNA 具有特征性改变，并被用作特定疾病的诊断标志物[13]。不仅特异性用于癌症的诊断、复发、监测疾病进展，而且是脑组织损伤时，是最具特异性、敏感性的标志物[14]，同时又具非侵入性诊断的新型生物标志物的潜力。以下主要从脑组织损伤后缺血缺氧性改变、炎症反应、神经细胞的凋亡及可塑性作进一步的阐述。

4.1 TBI 后局部的脑组织低灌注缺氧对于EXO miRNA 的影响

在TBI 后脑组织损伤过程中，多种EXO miRNA类型发生变化。通过调节其下游靶基因，参与缺血缺氧、炎症反应、神经细胞凋亡、神经元可塑性等过程，或减轻炎症反应，或加速级联反应，改善或加速神经功能障碍。

miRNA-210、miRNA-21 是细胞对组织局部缺血缺氧反应的主要参与者，具有促进血管生成的作用，在TBI 后神经功能恢复过程中起重要作用。Huang 等[15]研究结果发现miRNA-210 的启动子序列中含有低氧反应元件。生理条件下miRNA-210 的过表达，会促使血管结构的形成和血管内皮生长因子（ascular endothelial growth factor，VEGF）诱导的细胞发生迁移。研究显示[16]，miRNA-21 可通过上调下游靶基因VEGF、血管生成素（Angiopoietin-1，Ang-1）和血管生成素受体（receptor of Ang-1）的表达促进TBI 缺血病灶内血管的生成。相反，miRNA 亦可加速缺氧性损伤，对于缺血小鼠脑组织的相关研究发现miRNA-155 可作用于靶基因促进炎症介质释放，进而导致脑缺血缺氧性损伤[17]。亦有研究显示miR-497 可抑制靶基因bcl-2 和bcl-w 的表达，从而加剧缺血性病灶局部神经元的死亡[18]。

4.2 EXO miRNA 在TBI 后细胞凋亡和神经可塑性中的作用

EXO miRNA 不仅参与炎症反应、低灌注缺氧，而且在细胞凋亡和神经可塑性的过程中起关键性作用。Ge 及其同事[16]分析了TBI 后miRNA-21 对于脑神经功能的影响，结果显示TBI 导致脑皮质和同侧海马区中神经细胞的凋亡；而miRNA-21 在脑中的表达量的上调可以减轻神经细胞的凋亡。该团队通过对培养的脑微血管内皮细胞（BMVEC）进行刮擦建立损伤模型，从细胞层面观察到BMVEC 中的miRNA-21 的表达水平增加，可有效减轻细胞的凋亡和炎症反应[19]。

4.3 EXO miRNA 与TBI 炎症的关系

miRNA 在细胞的兴奋毒性、应激反应、炎症、细胞凋亡、脑水肿等多种病理生理变化过程起调控作用，提示其不仅可作为缺血性脑卒中的生物学标志物[20]，而且可协助早期诊断、预测预后及成为新药物的治疗靶点。炎症反应是导致TBI 患者继发性损伤的关键因素，也是影响TBI 患者预后的主要原因[7]。血管内皮细胞活化是炎症反应的主要部分，白细胞至内皮细胞信号传导对血管内皮细胞活化具有重要作用。EXO miRNA 由受体细胞分泌，与靶细胞的受体配体结合并作用于靶细胞，调节靶细胞的功能。

在所有EXO miRNA 中，miRNA-21、miR-124 是中枢神经系统中表达较丰富的类型，在生理和病理条件下都具有调节小胶质细胞功能的潜力[21]。

TBI 后miRNA-21 的表达明显上调，参与TBI 后组织损伤的多种病理过程。可作为TBI 患者诊断及预后指标的新型生物标志物[22]。Fabbri 等[23]研究显示，EXO miRNA-21 可以与巨噬细胞中的Toll 样受体（Toll-like receptor，TLR）8 结合，诱导TLR8 介导炎症反应，释放炎症介质，如肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α 和白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）。

EXO miRNA-124 作为为脑组织特异性miRNA，不仅调节辅助T 细胞的分化，而且对于被活化的T 细胞所分泌的细胞因子也有调节作用，是TBI 患者免疫失衡的重要调节位点。重度TBI 患者血浆中miRNA-124 的表达较对照组明显上调，与Treg 表达和IL-10呈正相关，调控炎症反应，可评估严重程度，具有成为预测TBI 预后的新型生物标志物的潜力[24]。

Yang 等[25]通过观察TBI 患者血清中miRNA 表达水平，评价miRNA 与患者病情的严重程度和临床结果的关系，发现TBI 患者（即重度、中度和轻度TBI 患者）血清中miRNA-93、miRNA-191 和miRNA-499 也是TBI 诊断、评估严重程度和预测预后的具有潜在价值的指标。Griffiths-Jones 等[26]研究发现血浆中不同miRNA 水平的变化可用来帮助确定TBI 的严重程度。研究显示，TBI 可能与miRNA 表达谱的改变有关。因此，需要更多的临床数据来证明EXOmiRNA 在TBI 中的生物学作用[27]。

细胞EXO 膜上包含的生物标志物（miRNA、DNA 等）可以追踪其原始细胞并确定与之相互作用的细胞[28-29]。加之具有脂质双层结构，易于通过血脑屏障，具有相对的生物稳定性，并能防止被血液和脑脊液内容物所降解[30]。这些特征使其作为TBI 和与TBI 相关的动态病理生理过程的候选生物标志物，以及作为输送治疗性分子的媒介具有一定优势。那么对于TBI 患者的准确诊断和预测预后是否单一联合较联合多基因的特异性、敏感性更佳或联合基因较单一基因的特异性、敏感性更佳呢？目前仍需要更多的研究来进一步明确。

5 小结

TBI 患者脑组织局部损伤后会发生一系列的病理生理变化，与此同时，伴随着多种生物分子学变化的过程。在TBI 的不同阶段中，有不同的miRNA 参与不同的病理、分子机制。对于同一疾病同一机制中是否伴随着多种miRNA 的变化，仍有待进一步研究阐明。

EXO 作为一个新兴的研究领域，在中枢神经系统，尤其是脑组织损伤的生物学作用尤其重要，加之其在体内存在的普遍性和易获取的特性，已作为疾病诊断治疗的新型有效方式。近年来，越来越多的研究证明EXO 是细胞间通讯、疾病诊断和预后循环生物标志物的重要载体。目前国内外相关研究仍局限于基础阶段，其在临床实践中的应用由于缺乏大量的数据进行验证，引起广大学者的关注，同时为TBI 研究者提供了新的研究思路。