不同质量卵裂期胚胎发育至囊胚能力的研究

王 慧 刘 帅 梁云浩 马才启 陈 娟 尹敏娜

广州市妇女儿童医疗中心 (广州 510623)

近年来，囊胚移植(blastocyst transfer，BT)因其能通过延长胚胎培养时间进一步筛选出发育潜能更高的胚胎，而越来越多的被临床应用。研究已证实囊胚移植同卵裂期胚胎移植相比，可以提高临床妊娠率及胚胎着床率，减低多胎率[1- 4]。因此目前，很多中心都采取将受精后第 3 天(D3)的胚胎继续行囊胚培养至第 5 天(D5)和第6 天(D6)的临床策略。但究竟什么质量的卵裂期胚胎有更好的囊胚发育潜能，还没有定论。目前，我们评价D3卵裂期胚胎质量的好坏主要依赖胚胎形态学评分，通过胚胎的生长速率、碎片多少及卵裂球均一性来评价。本研究的目的在于通过研究D3不同质量的卵裂期胚胎发育为囊胚的潜能，旨在为囊胚培养的结果预测提供参考。

1 资料与方法

1.1 研究对象

本研究回顾性分析2015年4月—2019年4月在广州市妇女儿童医疗中心生殖医学中心进行体外受精一胚胎移植(IVF—ET)治疗的患者，胚胎纳入标准为新鲜周期除去移植、冷冻剩余行囊胚培养的胚胎。经患者知情同意后将剩余胚胎(共5 510枚)转囊胚培养，继续观察并记录囊胚形成情况，有囊胚形成时根据形成囊胚的质量选择移植、冷冻或抛弃。

1.2 促排卵治疗方案及授精

所有患者使用本中心常规促排卵方案。阴道B超监测到3个或以上直径≥18 mm卵泡时，肌肉注射5 000 U～10 000 U HCG(雪兰诺，瑞士)，36 h后在阴道B超监测下采卵。

取卵日根据男方精子质量决定IVF或ICSI受精方式。授精18～20 h观察原核，受精胚胎放在胚胎培养液(G1，vitrolife,Sweden)液滴中，置于6%CO2培养箱培养。

1.3 D3卵裂期胚胎质量评估及分组

授精后D3根据胚胎形态学评估胚胎质量，记录卵裂球数量，胚胎碎片率及卵裂球不对称性等。评价标准：优质胚胎定义为受精后第3天胚胎卵裂球数目为7或8个，卵裂球大小均匀，及碎片<15%；其余为非优质胚胎。挑选胚胎移植或冷冻，剩余胚胎均经患者知情同意后转入囊胚培养液(G2，vitrolife,Sweden)液滴中，置于6%CO2培养箱进行囊胚培养。

根据D3转入囊胚培养的胚胎质量分为优质组(n=564)和非优质组(n=4 946)；根据D3转入囊胚培养的胚胎卵裂球数量分为<4细胞组(n=661)，4- 6细胞组(n=2 348)，7- 9细胞组(n=2 090)，>9细胞组(n=286)和融合期胚胎(Compact,CP)组(n=125)；根据D3转入囊胚培养的胚胎卵裂球均一性多分为卵裂球大小均匀组(-)(n=1 966)，卵裂球大小差异为(+)组(n=2 174)及卵裂球大小差异为(++/+++)组(n=1 370)；根据D3转入囊胚培养的胚胎碎片多少分为碎片≤10%组(n=2 939)，10%～25%组(n=1 574)及碎片>25%组(n=997)。

1.4 囊胚培养及观察

授精后D5及D6观察囊胚形成情况。囊胚评分采用Gardner评分方法[3]:根据囊腔扩张程度分为6 个时期。Ⅰ期：早期囊腔不超过囊胚总体积的1/2；Ⅱ期：囊腔体积超过囊胚总体积的1/2；Ⅲ 期：囊腔全占据整个囊胚；Ⅳ 期：囊腔继续扩张，透明带变薄；Ⅴ期：部分囊胚从透明带中孵出；Ⅵ 期：囊胚完全孵出。处于Ⅲ～Ⅵ 期的囊胚根据内细胞团和滋养层细胞质量进行分级。内细胞团分级：A 级细胞排列紧密且数量多，B 级细胞排列松散且数量较少，C 级细胞数量很少。滋养层细胞分级：A 级上皮细胞层结构致密且有较多细胞，B 级上皮细胞层结构松散且细胞不多，C 级上皮细胞层由稀疏细胞组成。

采用 Gardner囊胚分级系统[5]，将 D5评分≥ⅢBB、D6评分≥ⅣBB 定为优质囊胚，将 D5评分>ⅢCC、D6评分>ⅣCC 定为可利用囊胚。

1.5 评价指标

囊胚形成率=形成的囊胚数/转入囊胚培养的胚胎数；优质囊胚形成率=优质囊胚数/转入囊胚培养的胚胎数；可利用囊胚形成率=可利用囊胚数/转入囊胚培养的胚胎数。

1.6 统计学分析

数据分析使用SPSS 25.0统计学软件。计数资料以率(%)表示。率的比较采用χ2检验。描述各分析指标与囊胚培养结局的关系用二分类Logistic回归分析。显著性检验水准为α=0.05，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 D3胚胎质量评估的各指标与囊胚形成的关系

2.1.1 D3胚胎质量与囊胚形成的关系：与优胚组相比，D3非优质胚胎组囊胚形成率、优质囊胚形成率及可利用囊胚形成率差异有统计学意义(P<0.05)(表1)。

2.1.2 D3胚胎卵裂球数目与囊胚形成的关系：与7- 9细胞组相比，融合期胚胎(CP)组和> 9细胞组囊胚形成率、优质囊胚形成率及可利用囊胚形成率均没有统计学差异(P> 0.05)；与7- 9细胞组相比，4- 6细胞组和<4细胞组囊胚形成率、优质囊胚形成率及可利用囊胚形成率差异有统计学意义(P<0.05)(表2)。

2.1.3 D3胚胎卵裂球大小均一性与囊胚形成的关系 ：与卵裂球大小均匀(-)组相比，卵裂球大小差异为+组及卵裂球大小差异为++/+++组的囊胚形成率、优质囊胚形成率及可利用囊胚形成率差异有统计学意义(P<0.05)(表3)。

2.1.4 D3胚胎卵裂球碎片率与囊胚形成的关系：与碎片<10%组相比，碎片为10%～25%组及碎片>25%组的囊胚形成率、优质囊胚形成率及可利用囊胚形成率差异有统计学意义(P<0.05)(表4)。

表1 D3胚胎质量与囊胚形成的关系 n(%)

表2 D3胚胎卵裂球数目与囊胚形成的关系 n(%)

表3 D3胚胎卵裂球大小均一性与囊胚形成的关系 n(%)

表4 D3胚胎卵裂球碎片率与囊胚形成的关系 n(%)

2.2 Logistic分析

将上述因素分析中的差异因素，即D3胚胎质量、卵裂球数目、卵裂球均一性及碎片率做Logistic分析，用Forward LR方法，结果提示D3胚胎质量、卵裂球数目、卵裂球均一性及碎片率均与可利用囊胚形成显著相关(P<0.05)。随着D3胚胎质量的提高，卵裂球数目的增加，卵裂球均一性的提高，碎片率的减少，可利用囊胚形成也随之提高。其中，D3胚胎质量、卵裂球数目及均一性同可利用囊胚形成成正相关，碎片率同可利用囊胚形成成负相关。在这些因素中，D3胚胎质量和卵裂球数目对可利用囊胚形成有较大影响(表5)。

表5可利用囊胚形成多因素Logistic回归分析

3 讨 论

以往的常规体外受精-胚胎移植( IVF-ET) 治疗中，一般选择受精后D3的卵裂期优质胚胎移植。近年来，随着序贯培养体系的不断完善，囊胚培养变得相对成熟。有研究表明，囊胚培养不仅有利于提高移植周期的临床妊娠率和活产率[6- 7]，同时还可明显降低多胎妊娠的发生率[8- 9]。目前对于很多中心而言，胚胎常规体外培养至D3时，是否行囊胚培养，仍然需要我们根据D3胚胎质量和患者的具体情况作出选择。但究竟什么质量的卵裂期胚胎有更好的囊胚发育潜能，目前还没有定论。本研究回顾性分析了近四年来本中心新鲜周期中除去D3移植、冷冻外剩余行囊胚培养的5 510枚胚胎，探讨不同质量卵裂期胚胎和囊胚形成的相关性，为囊胚形成的预测提供依据。

对于卵裂期胚胎质量的评估，目前应用最广泛的依然是胚胎形态学评分系统。根据ESHERE 发布的2011 版Istanbul共识，在受精后(68±1)h观察胚胎，综合比较其卵裂球大小、数目、胞质碎片等参数来评价。我们中心根据这些指标综合评估将D3胚胎分为优质胚胎和非优质胚胎。近来，虽然有观点认为单从D3胚胎的形态来预测胚胎发育潜能不够精确[10]，但我们的研究结果仍然表明通过形态学评分选出的优质胚胎的囊胚形成各项指标都要远高于非优质胚胎(P<0.05)。非优质胚胎组的可利用囊胚形成率只有21.39%，这提示我们可以将D3的非优质胚胎进行囊胚培养，以淘汰掉一些发育潜能差的胚胎，在D5或D6再将可利用囊胚进行冷冻，这样可以降低患者的冷冻费用，为患者保存一些更有价值的胚胎。

我们的Logistic分析结果显示D3胚胎形态学评分的指标，包括卵裂球数目、均一性、胞质碎片等都同可利用囊胚形成显著相关(P<0.05)。相对而言，卵裂球数量比卵裂球均一情况及胚胎碎片含量更能预测胚胎的发育潜能。生长速率是评估胚胎潜在活力的有力指标。人类胚胎正常的发育速度是：受精后第1天为2细胞期，第2天为4- 6细胞期，第3天为7- 9细胞期。因此在 D3时，<7细胞胚胎发育较慢，>9细胞胚胎则发育较快。以往研究[11]表明，D3胚胎为7- 9细胞时，囊胚形成率最高，这说明卵裂速度过慢或过快都会对囊胚形成产生影响。但也有文献报道[12]D3卵裂期胚胎卵裂球数>9个的更容易形成囊胚。我们的研究结果表明D3发育较快的胚胎(CP组和>9细胞组)和发育速度正常的胚胎(7- 9细胞)相比，囊胚形成的各项指标并没有统计学差异。有学者[13]通过研究冻融周期中胚胎质量与囊胚形成之间的关系，发现7- 9细胞与>9细胞胚胎之间囊胚形成率相当，这与我们的研究结果一致。之前普遍认为D3为8细胞阶段的胚胎是理想的移植胚胎。但也有一些研究显示[14]发育较快的胚胎与8细胞胚胎有同等的临床结局,最近也有学者通过Time-lapse 挑选发育速度较快的胚胎移植，也获得较好的妊娠结局[15]。

胚胎发育过慢，往往预示着发育潜能较低,生长较慢的胚胎异常的发生率比正常发育速度的胚胎明显更高，胚胎质量较差导致移植后的临床妊娠率较低[16]。我们的结果也显示4- 6细胞组和<4细胞组的囊胚形成各项指标都要远低于> 6细胞的胚胎。对于D3发育速度较慢的胚胎，可利用囊胚形成率低，不过仍有部分具有发育至囊胚的潜能。因此在临床工作中，我们需在患者的囊胚培养费用和避免胚胎浪费等方面做出平衡，根据患者的不同情况综合考量这部分胚胎是否要行囊胚培养。

除了卵裂球数目是影响囊胚形成的一个重要因素外，胚胎碎片也与囊胚形成有关。碎片的形成可导致染色体异常，影响囊胚的形成。研究表明，移除碎片可以明显降低Ⅳ期胚胎的凋亡指数，有助于优质囊胚的形成[17]。 本研究的结果也显示碎片率较高的胚胎继续发育为囊胚及可利用囊胚的能力较差。

我们的结果显示D3卵裂球不对称的胚胎囊胚发育潜能要低于卵裂球对称的胚胎(P<0.05)。胚胎不对称性的发生可能影响卵裂球细胞骨架的变化趋势和极化，从而影响囊胚的形成。我们的Logistic分析结果显示卵裂球均一性同可利用囊胚形成均显著相关(P<0.05)。

综上所述，D3胚胎质量与囊胚形成密切相关。D3胚胎形态学评价的各项指标，包括卵裂球数目、均一性及胚胎碎片等均会影响到囊胚的形成及质量。我们可以通过D3胚胎质量预测其囊胚发育潜能，为患者提供最佳的个体化治疗方案。