Neurospora crassa 产木聚糖酶发酵条件及酶学特性

曹 慧 张朋振 张腾月，2 程 鹏 杨佳萌 任世威 井佳骐

(1.河南科技大学动物科技学院，河南洛阳471000；2.广东海洋大学农学院，广东湛江524088)

木聚糖是由多个D-木糖残基通过β-1，4 糖苷键连接而成[1]，是谷物及其副产品中非淀粉多糖的重要组分，是细胞壁中半纤维素的主要成分，是自然界中除纤维素外含量最丰富的多糖[2]，广泛存在于玉米芯、秸秆、麦麸、甘蔗渣等农作物废弃物中[3]。木聚糖酶能够水解木聚糖中的糖苷键并生成低聚木糖、木糖和阿拉伯糖降解产物[4]，在食品、饲料、造纸等行业有着广泛的用途。在饲料行业中，木聚糖酶可以通过降低食糜黏度、减少饲料内源损失、改善肠道内的菌群结构来改善畜禽生产性能，提高养分和能量的利用效率[5]；在造纸行业中，用于纸浆漂白，提高纸浆白度，减少化学漂白剂用量[6]；在食品行业中，木聚糖酶能显著提高全麦面包和冷冻面团面品质[7-8]。不同的应用环境对酶的要求不同，因此开发适用于不同用途的木聚糖酶非常必要，目前的研究热点主要是新酶的挖掘和酶分子改造[9-11]。

青藏高原被誉为世界屋脊，地球“第三极”，具有海拔高、辐射强、含氧量低、昼夜温差大等特点，其独特的自然地理环境赋予了青藏高原地区丰富而独特的微生物资源[12-14]。本研究团队前期从青藏高原土壤中分离出一株高产木聚糖酶菌株Neurospora crassaSD10，对菌株产木聚糖酶发酵条件进行优化，并对酶学性质进行研究，以期为今后构建木聚糖酶工程菌及其在生产上的应用打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种来源

从青藏高原(青海省海北州门源县，37° N、101° E)海拔3 175 m处采集土壤，经实验室分离、筛选出菌株Neurospora crassaSD10并保存。

1.1.2 培养基

发酵培养基：木聚糖5.0 g/L、NaNO33.0 g/L、K2HPO4·3H2O 1.31 g/L、KCl 0.5 g/L、蛋白胨3.0 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、FeSO4·7H2O 0.01 g/L、pH值5.5～6.0，121 ℃灭菌20 min。

1.1.3 主要试剂

木聚糖为自提玉米芯木聚糖，提取方法参考赵龙妹等[15]；3，5-二硝基水杨酸(DNS)试剂配制参考王明瑞等[16]；真菌基因组DNA 快速抽提试剂盒(上海生工生物工程有限公司)；琼脂粉(上海蓝季科技发展有限公司)；蛋白胨(北京奥博星生物技术有限公司)；磷酸氢二钾(天津市凯通化学试剂有限公司)；硫酸镁(上海强顺化工有限公司)；硝酸钠(成都市科龙化工试剂厂)；氯化钾(西陇化工股份有限公司)。

1.2 主要仪器设备

TGL-16G 高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂)、CX31 生物显微镜(OLYMPUS 有限公司)、超净工作台(苏净集团安泰公司)、LS-30 压力蒸汽灭菌器、THZ-92C 气浴恒温振荡器、SPX-150B-Z 型生化培养箱(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)、数显恒温水浴锅(常州人和仪器厂)。

1.3 试验方法

1.3.1 粗酶液制备

菌株接种于发酵培养基，28 ℃、200 r/min，培养72 h 后取发酵液12 000 r/min 离心10 min，制得上清液即为粗酶液。

1.3.2 木聚糖酶活力的测定

采用DNS 法测定木聚糖酶活力。75 μL 粗酶液(对照组粗酶液煮沸灭活)与675 μL 底物(1%木聚糖溶液)混匀，40 ℃水浴反应10 min，立即加入750 μL DNS 终止反应，沸水浴10 min 显色，冷却至室温后，540 nm 波长测定吸光度。每组试验设三个重复，取其平均值。

酶活力定义：在pH 值为7，40 ℃条件下，每分钟水解1%木聚糖产生1 μmol还原糖的酶量为一个酶活力单位，以“U/mL”表示。

1.4 酶学特性

1.4.1 温度对木聚糖酶相对酶活力的影响

测定粗酶液在20、30、40、50、60、70 ℃的木聚糖酶活力以确定酶的最适反应温度。粗酶液在40、50、60、70 ℃保温1 h后，40 ℃测定剩余木聚糖酶活力，确定酶的温度稳定性。

1.4.2 pH值对木聚糖酶活力的影响

测定粗酶液在pH 值为4、5、6、7、8、9、10 条件下的木聚糖酶活力以确定酶的最适反应pH值。粗酶液与pH 值为4、5、6、7、8 的缓冲液1∶1 混匀，保温1 h，40 ℃测定剩余木聚糖酶活力，确定酶的pH值稳定性。

1.4.3 金属离子对木聚糖酶活力的影响

在酶的反应体系中分别加入10 mmol/L 的Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Mn2+、Zn2+、Cu2+、Fe2+，以不添加金属离子为对照组，40 ℃测定木聚糖酶活力。

1.5 菌株发酵条件优化

1.5.1 营养条件对菌株产酶的影响

在初始发酵培养基基础上，考察不同碳源[羧甲基纤维素钠(CMC-Na)、葡萄糖、蔗糖、麸皮、木聚糖、玉米秸秆、玉米芯、花生秧]及碳源添加量(1%、2%、3%、4%、5%)对目标菌株产木聚糖酶活力的影响。考察不同氮源(尿素、硫酸铵、硝酸钠、蛋白胨、酵母粉、豆粉)及氮源添加量(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、3.0%、4.0%)对目标菌株产木聚糖酶活力的影响。考察不同金属离子(Na+、K+、Ca2+、Cu2+、Mn2+、Mg2+、Zn2+、Fe2+)及金素离子添加量(0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%)对目标菌株产木聚糖酶活力的影响。在28 ℃、200 r/min条件下振荡培养72 h测定木聚糖酶活力。

1.5.2 培养条件对菌株产酶的影响

在发酵培养基上，分别考察培养温度(18、23、28、33、38 ℃)、pH 值(5、6、7、8、9)、摇床转速(170、200、230 r/min)、接种量(2%、4%、6%、8%、10%)对目标菌株产木聚糖酶活力的影响，恒温振荡培养72 h测定木聚糖酶活力。

1.5.3 营养条件优化正交试验

在发酵条件优化结果基础上，以最佳碳源、氮源、金属离子为自变量，以酶活力为考察指标。每组试验设3个重复，按照L9(34)正交表进行正交试验。

1.5.4 菌株生长曲线和产酶曲线的测定

目的菌株在优化后的发酵条件下培养，每6 h 取样称重并测定木聚糖酶活力，绘制菌株的产酶曲线和生长曲线。

1.6 数据处理

用SPSS 20.0进行方差分析及差异显著性分析。

2 结果

2.1 酶学特性研究

2.1.1 温度对木聚糖酶相对酶活力的影响

以木聚糖酶相对酶活力最大值为100%。如图1(A)所示，木聚糖酶最适反应温度为50 ℃，在20～50 ℃之间相对酶活力随温度的升高而增大，在40～70 ℃之间相对酶活力保持在60%以上。

图1 温度对菌株SD10木聚糖酶相对酶活力的影响

如图1(B)，木聚糖酶相对酶活力在40～50 ℃相对酶活力能保持在80%以上，说明此酶在与动物体温接近的温度下(40 ℃)有较好的稳定性，当温度高于50 ℃时相对酶活力迅速下降。

2.1.2 pH值对木聚糖酶相对酶活力的影响

以木聚糖酶相对酶活力最大值为100%。结果如图2(A)所示，在pH 值4～6 之间相对酶活力随pH值的升高而增大，pH 值大于7 时相对酶活力快速下降。因此，该木聚糖酶相对酶活力最适反应pH 值为6。

图2 pH值对菌株SD10木聚糖酶相对酶活力的影响

如图2(B)所示，木聚糖酶相对酶活力在pH值4～8的范围内有良好的稳定性，相对酶活力均在80%以上。

2.1.3 金属离子对木聚糖酶相对酶活力的影响

以对照组木聚糖酶相对酶活力为100%。如图3所示，Fe2+、Zn2+、K+对木聚糖酶相对酶活力有促进作用，Na+、Mg2+、Ca2+对木聚糖酶活力有较弱的抑制作用，Mn2+、Cu2+对木聚糖酶相对酶活力有较强的抑制作用。

图3 金属离子对菌株SD10木聚糖酶相对酶活力的影响

2.2 菌株SD10发酵条件的优化

2.2.1 碳源对菌株SD10产木聚糖酶活力的影响

菌株SD10利用麸皮、玉米秸秆、玉米芯、花生秧产木聚糖酶的能力优于葡萄糖、蔗糖、CMC-Na、木聚糖产木聚糖酶活力(见图4)。麸皮为碳源时，木聚糖酶活力最高，其次是玉米秸秆和玉米芯；葡萄糖、蔗糖为碳源时，酶活力较低。因此，选取麸皮作为最佳碳源。

图4 不同碳源对菌株SD10产木聚糖酶活力的影响

图5 麸皮添加量对菌株SD10产木聚糖酶活力的影响

如图5所示，麸皮的添加量由1%增加到3%时木聚糖酶活力逐渐增加，添加量为3%以后木聚糖酶活力逐渐下降。可能是由于麸皮浓度过大形成较厚的悬浮物，使麸皮与发酵液混合不均匀，影响营养物质的利用，降低发酵过程中的溶氧量，不利于发酵产酶[17]。因此，选3%为麸皮最佳添加浓度。

2.2.2 氮源对菌株SD10产木聚糖酶活力的影响

图6 不同氮源对菌株SD10产木聚糖酶活力的影响

图7 蛋白胨添加量对菌株SD10产木聚糖酶活力的影响

如图6所示，蛋白胨为氮源时，菌株SD10产木聚糖酶活力最高，豆粉、硝酸钠为氮源时酶活力次之。因此，选择蛋白胨为最佳氮源。如图7 所示，蛋白胨添加量由1%增加到3%时，木聚糖酶活力逐渐升高。添加量为3%时，木聚糖酶活力最高，添加量继续增大，木聚糖酶活力下降。因此，选取3%为蛋白胨的最佳添加浓度。

2.2.3 金属离子对菌株SD10产木聚糖酶活力的影响

图8 不同金属离子对菌株SD10产木聚糖酶活力的影响

如图8 所示，培养基中添加Mn2+时，菌株SD10 产木聚糖酶活力最高，Mg2+、Na+次之。因此，选Mn2+为最佳金属离子。

图9 Mn2+的添加量对菌株SD10产木聚糖酶活力的影响

如图9 所示，Mn2+的添加量为0.1%时，菌株SD10产木聚糖酶活力最高，因此，选取0.1%为金属离子Mn2+的最佳添加浓度。

图10 培养温度对菌株SD10产木聚糖酶活力的影响

2.2.4 培养温度对菌株SD10产木聚糖酶活力的影响如图10 所示，培养温度在18～33 ℃时，随着温度升高，木聚糖酶活力逐渐增大，33 ℃时酶活力达最高值，高于33 ℃后木聚糖酶活力下降。因此，选取33 ℃作为最佳培养温度。

2.2.5 培养基初始pH 值对菌株SD10 产木聚糖酶活力的影响

图11 初始pH值对菌株SD10产木聚糖酶活力的影响

如图11所示，培养基初始pH值为5～8时，木聚糖酶活力随pH 值增大而升高，在pH 值为8 时，木聚糖酶活力达到最大。因此，选择pH 值8 为培养基初始pH值。

2.2.6 摇床转速对菌株SD10产木聚糖酶活力的影响

图12 摇床转速对菌株SD10产木聚糖酶活力的影响

如图12所示，随着摇床转速增加，木聚糖酶活力升高。摇床转速为230 r/min 时，木聚糖酶活力最大。因此，选取230 r/min为培养时的摇床转速。

2.2.7 接种量对菌株SD10产木聚糖酶活力的影响

图13 接种量对菌株SD10产木聚糖酶活力的影响

如图13 所示，接种量为2%时，木聚糖酶活力达到最高。接种量过大，菌体生长过快，代谢产物积聚抑制酶的合成，木聚糖酶活力持续下降。选取2%的接种量为最佳接种量。

2.2.8 营养条件优化正交试验

以麸皮添加量(A)、蛋白胨添加量(B)、Mn2+添加量(C)为自变量，菌株SD10木聚糖酶活力为考察指标，进行正交试验，按照L9(34)正交表设计（见表1），试验结果如表2所示。

由正交试验结果，通过R 值比较分析，对木聚糖酶活力的影响顺序为C＞A＞B，Mn2+添加量(C)是对木聚糖酶活力影响最大的因素，最佳培养基配方为A1B1C1(麸皮添加量30 g/L、蛋白胨添加量20 g/L、Mn2+添加量0.5 g/L)。

表1 菌株SD10营养条件优化的正交试验设计

表2 菌株SD10正交试验结果

2.2.9 菌株生长曲线和产酶曲线的测定

图14 菌株SD10的生长曲线和产酶曲线

如图14 所示，菌株SD10 的生长时期分别为：0～30 h 为迟缓期，生长曲线较平缓，菌体数量较少；30～60 h 为对数期，菌体数量快速增多，菌体代谢旺盛；60～66 h为稳定期，菌体的数量达到最大值；66 h以后为衰亡期，菌体数量开始下降。菌株SD10 所产木聚糖酶在0～18 h 时木聚糖酶活力处于较低水平且增速较慢，18～78 h木聚糖酶活力快速增大，在84 h时达到最大值，90 h之后开始下降。

3 讨论

木聚糖是半纤维素的主要成分，处于纤维素与木质素的交界处，维持纤维抱合力和细胞壁结构完整性[18]，所以木聚糖酶对木质纤维素的降解有重要作用。本研究选取菌株Neurospora crassa具有完整的木质纤维素降解酶系，能够合成多种纤维素酶、半纤维素酶和木质素酶，同时可以避免由纤维二糖积累引起的反馈抑制[19-20]。Neurospora crassa不仅具备强大的蛋白质表达和分泌能力，菌体内还含有丰富的蛋白质、维生素B12和多种酶类，而且具有培养简单，生长迅速，无霉菌毒素生成等优点[21-22]，因此可安全用于生产发酵。

本研究中Neurospora crassaSD10 木聚糖酶具有良好pH 值稳定性，在酸性和中性环境下都能维持80%以上的酶活力。经发酵条件优化后，菌株SD10最高酶活力达到9.4 U/mL，较初筛时提高了19.9 倍。在后续研究中可通过基因工程技术进一步提高木聚糖酶表达水平，改善木聚糖酶的酶学性质，为以后的工业应用奠定基础。

4 结论

从青藏高原土壤中筛选得到一株高产木聚糖酶菌株Neurospora crassaSD10，对其进行产酶条件优化及酶学性质研究，结果表明，菌株SD10产酶的最佳条件为：麸皮30 g/L、蛋白胨20 g/L、Mn2+0.5 g/L、培养温度33 ℃、转速230 r/min、接种量2%、发酵时间84 h、初始pH值8.0。菌株SD10所产木聚糖酶的最适反应温度为50 ℃，在40～50 ℃有较好的稳定性，能保持80%以上的酶活力。该酶最适反应pH 值为6.0，在pH 值4.0～8.0 之间酶活力稳定维持在80%以上；Fe2+、Zn2+、K+对酶活力有促进作用，Na+、Mg2+、Ca2+、Mn2+、Cu2+对酶活力有抑制作用。