肝癌患者组织中Cyclin E、p27kip1和Ki-67蛋白的表达与临床特征的相关性

王杉 梁鑫鸿 朱庚 李炎铭

我国是肝癌大国，肝癌发病率居消化道恶性肿瘤第4 位，死亡率居第5 位，由于早期缺乏典型临床症状和特征，约50%～75%患者确诊时已处于中晚期，无手术切除机会，5 年总体生存率低于45%，临床预后较差[1]。但是早期肝癌经手术治疗的5 年生存率可达70%～85%，因此，早期诊断和积极干预肝癌是提高患者生存预后的主要途经[2]。肝癌的发生与肝内胆管细胞异常增殖和凋亡减少有关，是多种癌基因或抑癌基因功能异常、氧化应激、炎症反应紊乱的综合结果[3]。其中细胞周期调控机制障碍在肿瘤细胞的增殖过程中发挥重要作用。细胞周期的顺序转换受到信号转导通路和反馈环路的精密调控，包括周期素（cyclins）、周期素依赖性蛋白激酶（cyclin dependent kinases，CDKs）和周期素依赖性蛋白激酶的抑制蛋白（cylin dependent kinases in inhibitors，CDKIs），多项研究证实，Cyclin E、p27kip1和Ki-67 蛋白是肿瘤细胞周期紊乱的重要分子标志，在肝癌、结直肠癌、宫颈癌等多种恶性肿瘤的发生和发展中扮演重要角色[4,5]。本次研究将进一步分析肝癌患者组织Cyclin E、p27kip1 和Ki-67 基因和蛋白的表达，分析与临床特征的关系，为疾病的早期诊断提供重要参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 回顾性选择2016 年7月至2019 年7月在浙江省医疗健康集团杭州医院经手术切除病理确诊肝癌患者共90例纳入观察组，纳入标准为：①年龄18～75岁；②符合肝癌病理诊断和手术切除指征，临床TNM 分期Ⅰ～Ⅲa 期；③首次接受治疗，既往无放化疗、生物治疗、抗病毒治疗史；④完整切除肿瘤病灶；⑤取得知情同意，临床资料完整。同期选择50例肝脏血管瘤患者为对照组，纳入标准为：①年龄18～75岁；②符合肝脏血管瘤相关诊断标准，且入院前未经过相关治疗；③完整切除肿瘤病灶；④取得知情同意，临床资料完整。排除标准为：①肝炎病毒感染、入院前肝硬化、严重肝肾心肺功能障碍；②凝血功能障碍；③其他部位原发肿瘤、肝内转移瘤。

观察组男性49例、女性41例；年龄48～73岁，平均（58.63±8.71）岁；TNM 分期中Ⅰ期28例、Ⅱ期35例、Ⅲa 期27例；肿瘤最大直径1.56～5.53 cm，平均（3.61±1.12）cm，均为单发肿瘤；细胞分化级别低分化42例、中高分化48例；血液转移18例、淋巴转移13例。对照组中男性26例、女性24例；年龄45～72岁，平均（58.24±8.32）岁；肿瘤最大直径1.37～5.84 cm，平均（3.73±1.42）cm，均为单发肿瘤。两组患者的性别、年龄和肿瘤最大直径比较，差异均无统计学意义（P均＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 免疫组染色法检测观察组肿瘤组织和癌旁正常组织以及对照组肿瘤组织的Cyclin E、p27kip1和Ki-67 阳性表达 常规开腹手术完整顺利切除两组肿瘤组织，观察组切除病灶范围应至少大于肿瘤边缘1～2 mm，术中冰冻证实切缘阴性。分别制作组织切片，厚度3 μm，经二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化、抗原修复后，首先滴加3% 双氧水溶液27 ℃孵育20 min，然后滴加正常山羊血清工作液，27 ℃孵育30 min，前期处理完毕后；滴加小鼠抗人Cyclin E、p27kip1、Ki-67 和内参蛋白β-actin 单克隆抗体一抗1∶2500（由美国Sigma公司生产）过夜孵育，磷酸盐缓冲液洗涤后滴加大鼠抗小鼠对应抗体二抗1∶500（由美国Sigma公司生产）室温静置孵育4 h；磷酸盐缓冲液洗涤、二氨基联苯胺显色、光学显微镜下观察。

1.2.2 反转录PCR（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）法检测对应mRNA 表达水平 各组样本组织经超声充分研碎，加入Trizol 试剂一步法提取细胞总RNA（根据试剂盒提示步骤进行），测量其浓度和纯度；逆转录试剂盒合成cDNA，设计目标引物序列（见表1）。反应体系包括cDNA 5 μl+正反向引物各0.5 μl+Taq 聚合酶0.5 μl，添加无菌反应水至总反应体系为25 μl。反应条件为95 ℃5 min，95 ℃20 s，60 ℃60 s，40 ℃20 s，共45个循环，95 ℃15 s、60 ℃60 s，熔解曲线，95 ℃15 s结束。结果以目标引物与内参引物条带灰度比值表示。

表1 各目标引物序列和大小

1.3 判定标准 免疫组染色法结果采用半定量法，根据染色强度和阳性细胞百分比，以胞浆或胞核黄染至深棕色为阳性，（-）计0分，（+）计1分，（++）计2分，（+++）计3分；阳性细胞百分比分别在≤5%计0分，6%～25%计1分，26%～50%计2分，51%～75%计3分，＞75%计4分；两项乘积0～3分为阴性，4～12分为阳性。

1.4 统计学方法 采用SPSS 20.0 软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差（）表示，比较采用t检验或单因素ANOVA 分析；计数资料以例（%）表示，比较用χ2检验。设P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组组织Cyclin E、p27kip1 和Ki-67 蛋白的阳性表达率比较见表2

表2 两组组织Cyclin E、p27kip1和Ki-67蛋白的阳性表达率比较/例（%）

由表2 可见，观察组肿瘤组织Cyclin E 和Ki-67阳性表达率比癌旁组织和对照组增加，p27kip1阳性表达率比癌旁组织和对照组降低（χ2分别=33.91、23.77；36.44、3.17；-16.36、-7.81，P均＜0.05）。

2.2 两组组织Cyclin E、p27kip1 和Ki-67 mRNAs表达水平比较见表3

由表3 可见，观察组肿瘤组织Cyclin E 和Ki-67 mRNAs 表达水平比癌旁组织和对照组增加，p27kip1 mRNA 表达水平比癌旁组织和对照组降低（t分别=20.40、17.47；11.26、9.69；-14.16、-14.84，P均＜0.05）。

2.3 观察组肿瘤组织Cyclin E、p27kip1 和Ki-67 蛋白的阳性表达与临床特征的关系见表4

表4 观察组肿瘤组织Cyclin E、p27kip1和Ki-67蛋白的阳性表达与临床特征的关系/例（%）

由表4 可见，观察组肿瘤组织Cyclin E、Ki-67和p27kip1 蛋白阳性表达与患者性别、年龄、肿瘤直径无关（χ2分别=0.64、0.18、0.51；0.49、0.17、0.62；0.02、1.44、0.86，P均＞0.05），但与肿瘤TNM 分期、血液或淋巴转移、肿瘤分化级别密切相关（χ2分别=19.00、7.32、10.40；10.79、7.79、9.37；15.26、6.58、6.67，P均＜0.05）。

3 讨论

肝癌的高发病率和高致死率严重威胁我国国民的生命安全，由于早期肝癌缺乏明显症状，大多数患者确诊时肿瘤已发展至中晚期，临床无有效的治疗方法，但对于早期肝癌患者采取手术切除肿瘤后能够大大提高患者的生存率，因此肝癌治疗的关键在于早期诊断。研究发现Cyclin E、p27kip1 广泛参与CDKs 的调控[6,7]，并且CDKs 的调控是细胞周期调控的关键环节[8]，而Ki-67 是与有丝分裂密切相关的核抗原，因此推测CyclinE、p27kip1、Ki-67 与细胞周期紊乱存在关系。目前已发现CyclinE、p27kip1、Ki-67 在多种癌症的发展进程中扮演重要角色，本研究主要在此基础上探讨其在肝癌的表达情况，并分析其与临床病理特征的关系，旨在为肝癌的早期诊断提高理论依据。

细胞周期可分为4个时期，即G1（DNA 合成前期）、S（DNA 合成期）、G2（DNA 合成后期）、M（有丝分裂期）。细胞是否进入分裂周期以及分裂周期是否能成功完成取决于调控细胞周期的重要稽查点，最重要的是G1/S 和G2/M 转换点，前者称为启动点，位于G1 期未，是细胞周期的起始点；后者位于M 期的起始点[9]。G1期是增殖细胞唯一能够接受外界增殖和增殖抑制信号的时期，调节细胞增殖及分化的事件主要发生G1 期，调控失常在肿瘤的发生、发展中发挥重要作用[10,11]。激活CDKs 在G1/ S 和G2/M转换过程中发挥关键性作用，其活性高低直接影响细胞周期的变化。CDKs 活性异常增加可使细胞呈现非抑制生长，形成肿瘤，CDKs 促进因子的过度表达或抑制因子的表达不足或缺失将导致细胞增殖失控而发生肿瘤[12]。Cyclin E 是CDKs 的正向调节因子，发挥细胞周期的正向调控作用[13]；CDKIs 能抑制CDKs 活性，发挥负向调控作用[14]。p27kip1 是CDKIs 家族的重要成员，p27kip1对Cyclin A-CDK2、CyclinE-CDK2 组蛋白H1 激酶样活性和pRb 磷酸化活性有很强的抑制性，使细胞阻滞于G1 期，抑制细胞增殖，从而发挥细胞周期的负向调控作用[15，16]。

本次研究结果发现，肝癌患者肿瘤组织Cyclin E和Ki-67 阳性表达率及mRNAs 水平比癌旁组织和肝脏血管瘤患者升高，p27kip1 阳性表达率及mRNA水平比癌旁组织和肝脏血管瘤患者降低（P＜0.05）。提示Cyclin E 和Ki-67 表达上调、p27kip1 表达下调发挥促进细胞恶性增殖的功能。Cyclin E、Ki-67 和p27kip1 表达异常仅出现在肝癌的肿瘤组织中[17]，在癌旁正常肝脏组织和肝脏良性肿瘤中则不表现异常的肿瘤周期分布。肝癌患者Cyclin E、p27kip1 和Ki-67 蛋白阳性表达与患者性别、年龄、肿瘤直径无关（P＞0.05），但与肿瘤TNM 分期、血液或淋巴转移、肿瘤分化级别密切相关（P＜0.05）。提示调控细胞周期的重要分子标志物Cyclin E、p27kip1 和Ki-67 可能主要影响了肿瘤细胞的TNM 分期、早期转移和肿瘤分化级别，同时也是肿瘤恶性程度的主要构成因素。也就是说Cyclin E、p27kip1 和Ki-67蛋白的异常表达主要影响了肝癌细胞的恶性增殖和早期转移，是临床预后较差的重要不利因素[18～20]。

综上所述，肝癌的发生和发展与组织Cyclin E、p27kip1 和Ki-67 蛋白的表达异常密切相关。本次研究不足是未能阐述Cyclin E、p27kip1 和Ki-67 蛋白是如何调控细胞周期的内在机制，以及特异性干预上述靶点能否改变细胞周期分布和肿瘤的恶性程度，还需要下一步实验进行验证。