高效液相色谱-质谱法对冠心病患者血清的脂质组学研究及其临床意义

王真昕，申华莉，杨芃原

(1.复旦大学 上海医学院 生物医学研究院,上海 200032;2.复旦大学 附属中山医院 检验科,上海 200032;3.复旦大学 附属闵行医院,上海 201199;4.复旦大学 化学系,上海 200433)

采用现代分析方法进行临床医学样本的分析检验已经成为生命科学中的一个重要领域,并已形成基因组学、蛋白质组学、脂质组学等分支学科,具有极大的临床医学价值。2003年,文献[1]根据生命新陈代谢过程会产生一系列脂质分子这一现象,提出了脂质组学概念。2014年,Nature发表了一系列针对脂质组学的评述[2-7],标志着脂质组学同基因组学、蛋白质组学一起,已经发展成为了生命科学领域的一个分支学科。脂质是一类具有疏水性或亲水亲油两亲性的小分子,已知的脂质分子有十万多种。人体血液中的脂质为人体新陈代谢紊乱的产物,而非过量饮食油脂形成的的剩余产物,它是一个由多种脂质分子形成的集合体。当血液中的脂质沉积在血管壁上形成斑块并导致血管堵塞时,就形成了动脉粥样硬化,这种疾病是冠心病(CAD)的早期病理现象。其冠状动脉闭塞持续时间不小于3个月,且存在0级血流的心肌梗死(TIMI)的患者被定义为冠状动脉慢性完全堵塞(CTO)患者,这类患者占所有冠心病患者的三分之一。这类疾病危险性大、且死亡率高。近年来,CTO 发病人数逐年增多,严重影响人民的生活质量,但是CTO 存在发病机制复杂、病因目前仍未阐明、预后较差且没有较为有效的治疗手段和药物等问题。针对这一现状,可采用现代分析方法寻找突破口。高效液相色谱-质谱法(HPLC-MS)因适合微量医学样本中生命物质、药物和代谢产物的检测而备受注目,目前在生物医学试样血样、尿样的检测与疾病相关的蛋白质、药物等的检测中已有应用[8-10]。

组学研究中,Shotgun法能够在海量的组学分子中最大限度地获取试样中的组学分子信息,是组学研究中首选的分析方法[11]。而Shotgun法的缺点是在进行质谱检测时,可能有部分中性分子被歧视而“丢失”,从而导致漏检。为此,试验采用多反应监测(MRM)法对中性脂质分子进行了补充检测。据此,本工作采用HPLC-MS对患者血清试样进行了脂质组学研究,将Shotgun法与MSM 法相结合,探查了患者在不同病患阶段时血清试样中脂质分子组成[如磷脂酰乙醇胺类化合物(PE)、磷脂酰胆碱类化合物(PC)、磷脂酰丝氨酸类化合物(PS)、磷脂酰甘油类化合物(PG)、磷脂酰肌醇类化合物(PI)、磷脂酸类化合物(PA)、溶血磷脂酰胆碱类化合物(LPC)、溶血磷脂酰乙醇胺类化合物(LPE)、胆固醇酯类化合物(CE)、三酰基甘油类化合物(TAG)、二酰基甘油类化合物(DAG)和鞘磷脂类化合物(SM)]的变化,从中找出与疾病发展密切相关的标志性脂质分子,并将这些脂质分子标志物应用于冠心病的临床诊断的早期预测以及手术后风险预测的评估,以期为脂质组学在CTO 临床医学中的应用提供技术参考。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Shimadzu LC-20AB HPLC 系 统;AB Sciex 6500 QTRAP型三重四极杆线性离子阱质谱系统;5810R 型离心机。

混合脂质内标溶液:由PE 15∶0/18∶1(d7)、PC 15∶0/18∶1(d7)、PS 15∶0/18∶1(d7)、PG 15∶0/18∶1(d7)、PI 15∶0/18∶1(d7)、PA 15∶0/18∶1(d7)、LPC 18∶1(d7)、LPE 18∶1(d7)、CE 18∶1(d7)、DAG 15∶0/18∶1(d7)、TAG 15∶0/18∶1(d7)/15∶0和SM 18∶1(d9)组成。

杜尔贝科磷酸盐缓冲溶液(DPBS),pH 为7.2。

异丙醇、甲醇、正己烷均为质谱纯;甲酸、氯仿、乙酸铵均为色谱纯;磷酸、氯化钾为分析纯。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 用于Shotgun法测定

电喷雾离子源(ESI),进样流量为10μL·min－1;正、负离子喷雾电压分别为5,－4.5 kV;扫描方式为母离子(PI)扫描结合中性丢失粒子(NL)扫描,扫描速率质荷比(m/z)200/s,扫描范围m/z400～1 000。

1.2.2 用于MSM 法测定

1)色谱条件 Phenomenex硅胶柱(250 mm×4.6 mm,5μm),柱温25 ℃;进样量10μL;流量300μL·min－1;流动相:A 为体积比为58∶40∶2的异丙醇-正己烷-100 mmol·L－1乙酸铵溶液的混合溶液,B为体积比为50∶40∶10异丙醇-正己烷-100 mmol·L－1乙酸铵溶液的混合溶液。梯度洗脱程序:0～10 min 时,B 由50%升至100%,保持10 min;20～21 min时,B 由100%降至50%,保持9 min。

2)质谱条件 ESI;正、负离子喷雾电压分别为5,－4.5 kV;MRM 模式;扫描范围m/z400～1 000。

1.3 试验方法

1.3.1 样本采集

将采集的样本分为四组:CTO 疑似人群(对照组)、CTO 患者组、CTO 患者在经皮冠状动脉介入治疗(PCI)手术后24 h 组,以及CTO 患者在PCI手术后72 h组(后3组分别对应PCI手术前、手术中和手术后,医学上统称“围术期”)。采集的全血血样在室温下静置1 h后,以3 000 r·min－1转速离心10 min,分离上层血清,在－80 ℃下冷冻储藏。

1.3.2 血清中脂质的提取

1)用于Shotgun法的脂质提取 将血清放在液氮中解冻并平衡至室温,摇动混匀。分取200μL血清于10 mL带有聚四氟乙烯盖帽的玻璃管中,每个样品加入10μL混合脂质内标溶液,再加入体积比为10∶10∶1的甲醇-氯仿-甲酸的混合溶液,于－20 ℃下静置过夜。最后加入含有1 mol·L－1氯化钾溶液 的0.2 mol·L－1磷酸溶 液2.2 mL,以3 000 r·min－1的转速离心5 min,静置,离心管中的样品溶液分成三层。用玻璃滴管穿过上层甲醇相,吸取含有脂质的中层相于另一个玻璃离心管中,再用1 mL三氯甲烷洗涤上层甲醇相,重复上述步骤两次,合并中层相。在室温下以温和的氮气气流吹干中层相,用1 mL流动相A 复溶,以12 000 r·min－1转速于4 ℃下离心45 min,按照1.2.1节仪器工作条件分析上清液。

2)用于MRM 法的脂质提取 将血清放在液氮中解冻并平衡至室温,加入10μL 的混合脂质内标溶液后,再将血清在液氮中反复冻融5 次,加入2 mL DPBS和2 mL体积比为25∶75的乙酸乙酯-异辛烷混合溶液,以1 000 r·min－1的转速离心5 min。用玻璃滴管吸取上层含有脂质的乙酸乙酯-异辛烷相到另一个玻璃离心管中,用1 mL 体积比为25∶75 的乙酸乙酯-异辛烷混合溶液洗涤下层DPBS相,重复上述步骤两次,合并乙酸乙酯-异辛烷相。用温和的氮气气流吹干乙酸乙酯-异辛烷相。加入1 mL含有100 mmol·L－1氢氧化锂溶液的甲醇复溶,以12 000 r·min－1转速于4 ℃下离心45 min。按照1.2.2节仪器工作条件分析上清液。

2 结果与讨论

2.1 质谱数据的脂质数据库检索和检索结果

用Shotgun法对脂质提取上清液进行分析,通过仪器自带软件Analyst 1.6对质谱获得的脂质数据进行脂质数据库检索,并通过生物信息学工具“Lipid MS Predict”[12]确认脂质分子。结果发现:在4组样本中总共鉴定得到1 504种脂质分子,确定了链长在15～65(碳原子数)之间的脂肪酸侧链分布。其中,CTO 患者组血清中的TAG 类化合物含量上升、DAG 类化合物含量下降;其中具有C14∶1、C18∶2和C19∶0脂肪酰基链的分子被鉴定为具有标志性差异的脂质分子,特别是C14∶1,其在CTO 患者组中降低特别显著,术后其含量趋于正常。对于CTO 疑似人群及PCI手术前、手术中及手术后的CTO 患者,对应血清中的脂肪酰基在围术期的不同时段存在明显的变化趋势[13],具有显著的识别作用。

2.2 脂质组学研究结果及其临床医学意义

用MRM 法进一步对脂质提取上清液分析,共获得631个具有临床意义的脂质分子,包括在正离子模式下检测得到的403个脂质分子(以PA、CE、PE、PC和SM 类化合物为主),和在负离子模式下检测得到的228个脂质分子(以PS、PI和PG 类化合物为主)[12]。

对CTO 早期诊断及CTO-PCI手术后风险预测密切相关的脂质主要是DAG、PA、PC 以及SM类化合物。采用变量投影重要性(VIP)准则进行统计分析并筛选出对区分效果贡献较大的标志性差异脂质分子,在筛选出的210个标志性差异脂质分子中,VIP值最高的3个脂质分子分别为PA 10∶0/19∶0、LPE 18∶0以及CE 16∶1,这3个脂质分子对于PCI手术前、中、后等3样本的区分具有标志性的作用。VIP 值最高的15 个差异脂质分子中,LPE类化合物占5个,均在CTO 对照组中呈高水平分布,但它在CTO 患者中的分布下降,在PCI手术后的分布降至最低。与之相反的是,CE 类化合物在CTO 患者血清中的分布水平都显著高于对照组的。

通过受试者工作特征(ROC)曲线进行分类评价,得到179个评价曲线下的积分面积(AUC)大于0.6的脂质分子,这些分子对于CTO 具有高诊断价值,尤其是积分面积大于0.9 的9 个脂质分子,即LPE 18∶1、LPE 18∶0、CE 16∶1、LPE 18∶2、PC 34∶2、LPE 17∶0、神经酰胺Cer 18∶1/24∶1、SM 18∶1/16∶0以及SM 18∶1/18∶0,对早期诊断、判定具有确切价值。

结合临床回访结果和脂质组学分析数据,可以发现:与预后良好的CTO 患者相比,预后不良的CTO 人群存在术前PA 类化合物升高,PC 类化合物降低。尤其是PA 的升高与预后不良呈正相关。PA 18:3/19∶0、PA 17∶2/20∶1以及PA 13∶0/18∶1升高的患者在手术后更加趋向于发生心肌损伤或者发生血管再狭窄。从术后脂质分布水平来看,术后CE分布水平的差异可预示不同的中长期预后情况,CE 16∶1、CE 24∶0升高或CE 19∶0下降的患者预后趋于不良。这些结果对术后风险预测具有实际的临床医学意义。

本工作采用HPLC-MS研究了CTO 疑似人群及CTO 患者在手术前、手术中和手术后的血清样本,对得到的质谱数据进行了质谱库检索。利用脂质组学研究确认了标志性脂质分子,结果对心血管疾病的临床早期诊断和手术后风险预测具有明确的指导意义。