长白落叶松HD-Zip基因对外源激素的响应模式1)

吕思毓 安旆其 王朋阳 刘牧田 吕汐 祁明惠 张磊

(林木遗传育种国家重点实验室(东北林业大学)，哈尔滨，150040)

同源异型域—亮氨酸拉链(HD-Zip)蛋白属于植物特有的转录因子，参与调控植物的生长发育过程，对于植物组织分化也有重要意义。HD-Zip包含一个由61个氨基酸构成的高度保守的同源异型域HD(Homeodomain,HD)和紧随其后的亮氨酸拉链(Leucine zipper,LZ)结构域[1]，共包括4个亚家族。

HD-Zip基因家族在林木的研究范围非常广泛，例如龙眼(拉丁名称)体胚发生过程中鉴定得到的HD-Zip基因家族成员可能参与调控根的发育及果实的形成[2]；白桦(拉丁名称)在应答盐胁迫的过程中有7条HD-Zip基因的表达量有变化[3]；小黑杨(拉丁名称)中鉴定得到的63条HD-Zip基因在盐胁迫条件下叶中有25个HD-Zip基因下调表达，21个基因上调表达，茎中有42个基因下调表达，11个基因上调表达，根中有26个基因下调表达，24个基因上调表达[4]；茶树(拉丁名称)的HD-Zip家族转录因子IV亚族的CsHB1基因在不同非生物胁迫处理下均能诱导表达,且表达差异性明显，证实该基因家族可以参与光信号转导、非生物胁迫响应、胚胎发育、分生组织形成等多种过程[5]。Soderma et al.[6]利用激素突变体进一步研究发现,ATHB6和ATHB7的表达主要依赖于ABA途径在转录水平上调节的,同时它们在体内的活性还受到丝氨酸/苏氨酸磷酸酶(ABI1和ABI2)的调控。Komatsuda T, et al.[7]发现HAHB10参与GA的转导途径；Himmelbach et al.[8]对模式植物拟南芥ATHB6的启动子表达分析后,发现ATHB6启动子的活性随着外源ABA浓度的升高而上升。由此猜测ATHB6可能是与特异的ABA信号通路匹配的主要开关。

植物激素生理效应复杂多样，可以从影响细胞分裂、伸长、分化到影响植物发芽、生根、开花、结实、性别决定、休眠、脱落等。吲哚—3—乙酸(IAA)是一种用作刺激植物生长的激素，对植物抽枝或芽、苗等的顶部芽端形成有促进作用[9]；赤霉素(GA3)可以促进植物的生长发育，提早成熟[10]，提高产量和打破休眠[7]，促进发芽、分蘖、抽苔，提高果实结果率[11]；脱落酸(ABA)是一种抑制生长的植物激素，它的作用与IAA等生长类激素相反，对细胞的分裂与伸长起抑制作用，还能抑制胚芽鞘、嫩枝、根和胚轴等器官的伸长生长[12]，一般来说，干旱、寒冷、高温、盐渍和水涝等逆境都能使植物体内ABA迅速增加，同时抗逆性增强[13]。通过对长白落叶松HD-Zip基因响应IAA、GA3和ABA这3种外源激素处理的应答模式分析可以为该基因家族在针叶树种的主要功能研究奠定基础，同时为长白落叶松分子育种遗传改良提供重要的基因资源。

1 材料与方法

1.1 长白落叶松HD-Zip基因

根据实验室前期基因挖掘的数据，获得2条HD-Zip家族基因，分别命名为LoHDZ1和LoHDZ3，其分别属于HD-Zip I亚家族HD-Zip II亚家族。

1.2 落叶松幼苗

试验所用的材料取自于黑龙江省鸡西种源的长白落叶松种子。选取饱满表面有光泽的长白落叶松种子，用去离子水浸泡约1周，期间换水3～4次，之后播种于V(豁土)∶V(蛭石)∶V(珍珠岩)=5∶3∶2的营养土基质(本试验用到的基质都为按此比例配置的营养土)中，覆膜保湿，植物生长培养条件为16 h光照，8 h黑暗，湿度为75%，温度恒定为22 ℃。

1.3 落叶松HD-Zip转录因子基因的生物信息学分析

利用BioEdit软件对长白落叶松的HD-Zip转录因子蛋白序列进行比对分析，利用ExPaSy在线软件(http://web/expasy/org/protparam/)对HD-Zip基因的蛋白分子质量和等电点等理化属性进行分析。用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)对2条落叶松HD-Zip转录因子蛋白序列的二级结构进行预测分析，并用SWISS MODEL程序对上述2条蛋白序列进行三级结构同源建模。

1.4 外源激素处理

待落叶松的针叶完全伸开后挑取长势良好的小苗移栽至养苗盆于营养土基质中继续培养至2～3个月后，用浓度为50 mg/L的IAA、GA3和ABA溶液以及水(对照)喷施落叶松苗，并分别于2、4、8、12、24、48、72、96 h取整株落叶松苗提取RNA并反转录为cDNA。ABA，IAA，GA33种激素处理浓度参照栾嘉豫[14]等人的报告。

1.5 RNA提取及cDNA合成

本试验采用PureLinkTMPlant RNA Reagent试剂盒提取激素处理后的长白落叶松试验样品RNA，提取步骤按照RNA提取试剂盒的方法进行；采用反转录Prime Script RT reagent Kit Perfect Real Time(TaKaRa)试剂盒将长白落叶松的试验样品进行反转录得到cDNA。

1.6 qRT-PCR

利用Primer5软件设计基因定量引物(表1),利用EXCEL处理数据，分析HD-Zip基因的表达量。

表1 基因定量引物

2 结果与分析

2.1 落叶松HD-Zip转录因子基因的理化性质

将获得的2条落叶松HD-Zip转录因子基因序列，利用软件工具等进行分析的结果表明：LoHDZ1基因全长为1 057 bp，CDS区域为343 bp，相对分子质量为12 439.37，其蛋白等电点为7.04，蛋白脂肪系数为72.34，蛋白疏水性平均系数为-0.682。LoHDZ3基因全长为996 bp，CDS区域为291 bp，相对分子质量为37 507.45，蛋白的等电点为4.69属酸性范围内，蛋白脂肪系数为66.31。

两条基因蛋白脂肪系数均高于50，表明其蛋白热稳定性较高。LoHDZ1，LoHDZ3蛋白疏水性平均系数为-0.824，表现为亲水性。信号肽分析和蛋白跨膜分析结果表明，LoHDZ1和LoHDZ3蛋白不具信号肽，均为非分泌蛋白及非跨膜蛋白(图1)。

a为LoHDZ3蛋白质的氨基酸组成分析；b为LoHDZ3蛋白质的信号肽组成；c为LoHDZ3蛋白质三级结构；d为LoHDZ3蛋白质二级结构，其中红色为螺旋，蓝色为无规卷曲，白色为β转角。

2.2 激素胁迫对长白落叶松HD-Zip转录因子基因表达影响

2.2.1GA3处理下的LoHDZ1、LoHDZ3的表达量

在长白落叶松幼苗施用GA3处理之后，LoHDZ1与LoHDZ3基因的表达量变化趋势基本抑制，LoHDZ1基因表达量均明显低于对照，LoHDZ3基因表达量也存在不同程度的下调表达，尤其是在2、4 h基因的表达量明显低于未处理时期，说明喷施GA3后LoHDZ1和LoHDZ3基因活性受到抑制(表2)。

表2 LoHDZ1以及LoHDZ3在GA3处理下表达量

2.2.2IAA处理下的LoHDZ1、LoHDZ3的表达量

长白落叶松幼苗中的LoHDZ1基因表达量在生长素IAA处理后的2、4、12、48 h明显上调表达，LoHDZ3在处理后12 h内表达量略有增加，48 h达到最大，约为未处理的10倍左右。两条基因的表达量在72 h之后与未处理相比发生明显下调(表3)。

表3 LoHDZ1与LoHDZ3在IAA处理下表达量

2.2.3ABA处理下的LoHDZ1、LoHDZ3的表达量

经过ABA激素处理植株之后，LoHDZ1与LoHDZ3的基因表达量与未处理时相比大多为下调表达，LoHDZ1基因受到了极大程度的抑制，可推测该基因对于ABA激素的敏感度极高。即便是在处理后48 h表达量最大时也只有未处理时的1/5。LoHDZ3在2到12 h基因表达量明显下降，在24 h时表达量为未处理时的1.5倍，72 h时表达量约为未处理时的1.3倍，可以初步推测LoHDZ3可以响应ABA处理，可能与植株抗逆性有一定关系(表4)。

表4 LoHDZ1与LoHDZ3在ABA处理下表达量

3 结论与讨论

经过3种不同类型的激素处理后，由于分别属于HD-Zip I亚家族HD-Zip II亚家族，所以LoHDZ1与LoHDZ3基因的表达模式并不完全一致。从模式植物拟南芥以及水稻的研究来看,HD-Zip家族转录因子亚家族I和II基因表达受干旱、高盐、ABA和冷害等环境的诱导,这两类基因参与激素信号途径,通过调控与激素途径相关基因和下游基因互作来调控植物细胞扩增、分裂和分化，从而提高植物耐逆性[15]，HD-Zip I亚家族主要在光信号转导、非生物胁迫、叶片发育等方面发挥重要作用，而HD-Zip II蛋白的功能为介导植物对环境改变的应答并调节其发育过程[16]。HD-Zip I亚家族的相关研究表明其功能较为广泛，例如番茄[17]、甘蔗[18]等植物中HD-Zip I亚家族基因在不同组织部位的表达特异性能证实该类基因可能参与调控植株不同组织器官生长发育的过程，特别是甘蔗GT1基因是HD-Zip I同源基因，在HD-Zip I家族蛋白的主要结构域上表现出高度的保守性，表明甘蔗GT1基因也可能参与了甘蔗关键发育过程的调控[18]。苹果当中鉴定得到22条HD-ZipⅠ基因可以分别响应赤霉素、细胞分裂素、茉莉酸、乙烯和脱落酸的顺式作用元件[19]。其中MdHZ1和MdHZ17可能与果实的后熟进程有较为紧密的联系，可以作为候选基因进行果实后熟相关方面的深入研究。HD-Zip II转录因子控制激素调控发育的过程，缺失后将对植物生长素分布和响应产生影响[20]。例如油棕EgHOX1属于HD-Zip II亚家族基因，其在胚胎发生诱导的早期组织培养阶段检测到高水平表达，但外源生长素对其诱导作用不明显，而脱水和渗透胁迫对其诱导作用明显[21]。桃树中的HD-Zip II亚家族基因PpHB.G7在成熟果实中表达量高[22]。

在生长素IAA处理长白落叶松幼苗后，LoHDZ1的表达量在4 h内明显上调表达，而LoHDZ3基因的表达量只是略有增加，说明其对生长类激素处理响应程度不同，LoHDZ1更容易被IAA调控表达。GA3处理后2条基因与对照相比表达量变化趋势基本一致，因为赤霉素主要功能是促进植物生长，也能促进或控制內源生长素的合成与降解，避免生长素浓度过高及抑制时间过长致使植株生长减缓、停止甚至死亡。而ABA处理后LoHDZ1表达量较对照相比明显下调，LoHDZ3在24和72 h时表达量升高，其余时期的表达量也均低于未处理时期。ABA对生长的作用与IAA、GA等相反，同时在植物对胁迫环境抗逆性中发挥重要作用。由此推断LoHDZ1受到ABA的抑制，参与调控植物生长发育，不参与调控非生物胁迫过程，拟南芥第II亚类HD-Zip蛋白基因中有9个成员: ATHB2/HAT4,ATHB4,HAT1，HAT2,HAT3,HAT9,HAT14,HAT17和HAT22[23]。Steindler et al.[24]发现ATHB2的表达水平会影响生长素的信号途径，表明其可能参与植物生长发育过程；过量表达拟南芥HAHB10后发现转基因植株叶子的形状、颜色,以及植株生长率、开花时间和生命周期都受到了影响,而用GA处理转基因植株之后,植株形状指标又会恢复原状[25],表明HAHB10参与拟南芥生长发育过程。而LoHDZ3在用赤霉素处理后相对于对照组呈现明显的差异性表达，推测其功能可能与大多数HD-Zip II亚家族基因一致，参与调控植物对胁迫的应答并调节生长发育部分过程。