番茄皮渣中番茄红素和多糖的提取

2021-03-05邓龙付晓茜贾梦真党艳艳

食品工业 2021年2期

邓龙，付晓茜，贾梦真，党艳艳*

石河子大学化学化工学院/新疆兵团化工绿色过程重点实验室（石河子 832003）

番茄加工会产生大量的番茄皮渣，加工番茄酱产生的工业废弃物主要由番茄皮、番茄籽和黏浆状物质组成，数量占到加工用原料的40%[1]。新疆是我国主要的番茄酱加工基地，据不完全统计，2018年全区番茄种植面积达到110多万亩（1亩=0.067 hm2），番茄酱总产量达到101.83万 t。番茄酱加工产生的副产物中番茄红素含量可达果肉中的5倍之多，具有清除自由基、促进细胞间的连接与传导、防癌抗癌等多种生理功能，在制药、食品加工、化妆品领域有很高需求[2-3]。番茄中的番茄红素大部分是以与脂蛋白结合的形式存在于色素母细胞中[4]，传统的提取方法无法通过紧密的植物组织将溶剂完全分散，使提取过程困难。此外，番茄皮渣中还有多糖、蛋白质、番茄籽油等有效成分。多糖由于结构复杂多变，具有多种药理活性，可作为食品、建筑及造纸的原料[5]。

近年来，双水相萃取技术由于在常温、常压下操作，具有有机溶剂用量少、能耗低、产品收率高等优点，被广泛应用于植物中有效成分的提取分离[6-8]。因此，采用酶辅助双水相萃取番茄皮渣中的番茄红素和多糖，利用响应面法对工艺条件进行优化，并对提取物的抗氧化活性进行测定，为番茄皮渣的综合利用提供一种新思路。

1 材料与设备

1.1 材料与试剂

番茄皮渣来自新疆石河子市某公司，分离皮籽并在室温下阴干后粉碎过筛。番茄红素标准品，购自北京索莱宝科技有限公司；果胶酶（30 U/mg）、菠萝蛋白酶（300 U/mg），购自上海麦克林生化科技有限公司，1, 1-二苯基-2-苦基肼（DPPH），阿拉丁试剂；其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

UV-5100B紫外可见分光光度计，上海棱光技术有限公司；BSA223电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；DK-8D型电热恒温水槽，上海精宏实验设备有限公司；台式高速大容量离心机，Eppendorf中国有限公司。

2 试验方法

2.1 酶辅助双水相体系提取番茄皮渣中番茄红素和多糖

准确称取0.25 g粒度97 μ m的样品和一定质量的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液，与酶混合均匀，在恒温水浴锅中进行酶解；酶解反应完成后，迅速加入一定质量的磷酸氢二钾盐使其溶解，然后加入无水乙醇混合，在避光条件下静置1.5 h，读取上相和下相体积，测定番茄红素和多糖的得率及回收率。提取物的得率（Y）和回收率（R）式（1）～（3）计算。

式中：YL为番茄红素的得率，mg/100 g；YP为多糖的得率，mg/g；Ct和Cb分别为上、下相提物的质量浓度，mg/mL；Vt和Vb分别为上、下相的体积，mL；M为番茄皮渣粉末的总质量，g。

2.2 酶辅助双水相提取番茄皮渣中番茄红素和多糖的单因素试验

通过单因素试验，考察酶种类及组成、酶质量分数、pH、酶解温度和酶解时间对酶辅助双水相提取番茄皮渣中番茄红素和多糖得率的影响，重复3次平行试验，试验结果取平均值。

2.3 测定方法

1) 采用分光光度法[9]测定番茄红素的含量。取上相提取液在503 nm处测定吸光度。番茄红素标准溶液的质量浓度与吸光度的线性回归方程为y=0.061 6x+0.005 2（R2=0.999）。

2) 采用苯酚-硫酸比色法[10]测定多糖含量。取1 mL稀释一定倍数的提取液于10 mL试管中，加入1 mL 5%苯酚溶液和5 mL 98%硫酸，静置10 min，混合均匀，冰浴1 min，在30 ℃水浴20 min后在490 nm处测定吸光度。葡萄糖标准溶液的质量浓度与吸光度的线性回归方程为y=0.010 8x-0.003 7（R2=0.999）。

2.4 响应面优化试验

采用Box-Behnken设计原理，以酶质量分数、酶解温度及酶解时间为自变量，以番茄红素及多糖得率为响应值进行响应面设计。试验因素与水平的设计见表1。

2.5 番茄皮渣提取物的抗氧化性能测定

DPPH自由基清除能力测定[11]：向试管中分别加入不同浓度的样品液和2 mL的DPPH溶液，混合均匀后在25 ℃条件下避光反应30 min，在517 nm处测定吸光度。

表1 响应面试验因素水平

3 结果与分析

3.1 乙醇质量分数对番茄红素和多糖提取的影响

固定K2HPO4质量分数17%，考察乙醇质量分数对番茄红素及多糖提取的影响。如图1所示，随着乙醇质量分数的增加，番茄红素和多糖的得率均呈现先增加后减少的趋势。当乙醇质量分数为29%时，多糖得率达到最大值（60.03 mg/g）；当乙醇质量分数达到31%时，番茄红素得率达到最大值（8.40 mg/100 g），且多糖的回收率也达到最大值。适当的增大乙醇质量分数可以提高有效成分的提取得率，但过高的乙醇质量分数也会使目标产物得率和回收率下降[12]。因此，选择31%乙醇进行下一步试验。

图1 乙醇质量分数对番茄红素和多糖提取的影响

3.2 磷酸氢二钾质量分数对番茄红素及多糖提取的影响

固定乙醇质量分数31%，考察K2HPO4质量分数对番茄红素和多糖的提取影响，结果如图2所示。当K2HPO4质量分数为16%时，番茄红素和多糖的得率分别达到最大值（8.7 mg/100 g和60.73 mg/g），多糖回收率为84.55%。继续增加磷酸氢二钾质量分数，番茄红素和多糖的得率开始降低，说明过高的盐浓度不适于有效成分的提取，这与文献[13]报道一致。因此，选择16% K2HPO4进行下一步试验。

图2 K2HPO4质量分数对番茄红素和多糖提取的影响

3.3 酶辅助双水相提取番茄红素和多糖单因素试验

3.3.1 酶种类对提取番茄红素和多糖的影响

在pH 5.5、酶质量分数1.0%、提取温度45 ℃、酶解时间60 min的条件下研究酶的种类及组成对番茄红素和多糖提取的影响，结果如图3所示。当果胶酶-菠萝蛋白酶为1∶1时，番茄红素的得率最高（11.15 mg/100 g），多糖的得率和回收率随果胶酶比例的减少而降低。说明等比例混合的果胶酶与菠萝蛋白酶可以促使番茄皮细胞中果胶物质及游离的蛋白质水解，有利于番茄红素的提取。综合考虑，选择果胶酶-菠萝蛋白酶1∶1的混合酶用于酶解番茄皮渣。

图3 酶的类型和组成对番茄红素和多糖提取的影响

3.3.2 酶质量分数对提取番茄红素和多糖的影响

在pH 5.5、提取温度45 ℃、酶解时间60 min的条件下考察混合酶质量分数对番茄红素和多糖提取的影响，结果如图4所示。当酶质量分数为2.0%时，番茄红素和多糖有最高提取得率，分别为13.83 mg/100 g和61.6 mg/g。但酶质量分数的进一步增加并没有有效地提高番茄红素和多糖的得率，反而略有下降，该现象与文献[14]报道一致。因此，在不影响提取效果的前提下考虑节约成本，选择2.0%作为最佳酶质量分数。

图4 酶质量分数对番茄红素和多糖提取的影响

3.3.3 缓冲液pH对提取番茄红素和多糖的影响

在混合酶质量分数2.0%、提取温度45 ℃、酶解时间60 min的条件下，考察缓冲液pH对番茄红素和多糖提取的影响，结果如图5所示。当pH为6.0时，番茄红素和多糖的提取得率最高，分别为13.82 mg/100 g和62.07 mg/g。说明混合酶酶解番茄皮渣的最适pH为6.0，在此条件下混合酶活性较高，降解番茄皮细胞壁的能力最强。

图5 缓冲溶液pH对番茄红素和多糖提取的影响

3.3.4 酶解温度对提取番茄红素和多糖的影响

在混合酶质量分数2.0%、pH 6.0、酶解时间60 min的条件下考察混合酶酶解温度对番茄红素和多糖提取的影响，结果如图6所示。番茄红素和多糖的提取得率随着酶解温度的升高先增加后降低，在50 ℃时番茄红素的提取得率有最大值（14.39 mg/100 g）。随着温度的继续升高，番茄红素的提取得率呈下降趋势，而多糖的提取得率还呈上升趋势，说明过高的温度不利于番茄红素的提取，当温度超过60 ℃后，混合酶部分失活[15]，造成原料酶解不完全，降低了番茄红素和多糖的提取得率。因此，选择50 ℃为最佳的酶解温度。

图6 酶解温度对番茄红素和多糖提取的影响

3.3.5 酶解时间对提取番茄红素和多糖的影响

在混合酶质量分数2.0%、pH 6.0、酶解温度50 ℃的条件下，考察混合酶酶解时间对番茄红素和多糖提取的影响，结果如图7所示。当酶解时间为120 min时，番茄红素和多糖的提取得率有最大值，分别为15.66 mg/100 g和72.54 mg/g。随着酶解时间的继续增加，有效成分提取得率开始下降，该现象与文献[16]报道一致。因此，选择120 min为最佳酶解时间。

图7 酶解时间对番茄红素和多糖提取的影响

3.4 响应面法分析

3.4.1 Box-Behnken试验设计与结果

响应面试验结果如表2所示，其中YL，YP分别为番茄红素和多糖的得率。

3.4.2 响应面方差分析

利用Design Expert 8.0.6软件对数据进行整理与分析，试验设计及结果见表3。番茄红素和多糖得率模型均具有极显著特性（p＜0.01）。对番茄红素而言，A、B、AB、BC、A2、B2和C2对得率表现出极显著的影响，影响因素从大到小依次排序为A＞B＞C。对于多糖而言，A、A2、B2和C2对得率表现出极显著影响，影响因素从大到小依次排序为A＞C＞B。

表2 响应面设计与结果

表3 响应面试验方差分析

以番茄皮渣中番茄红素得率（YL）和多糖得率（YP）为响应值，酶质量分数（A）、酶解温度（B）、酶解时间（C）为自变量，对试验数据进行多远回归分析，得到二次多项式回归方程：

YL、YP模型的相关系数R2分别为97.47%和97.57%，矫正决定系数R2Adj分别为94.21%和94.45%，说明该模型拟合度高且试验误差在正常范围内。

3.4.3 响应面验证试验

根据建立二次回归方程模型及响应面图，预测酶辅助双水相提取番茄红素和多糖的最优工艺条件：酶质量分数2.0%、酶解温度50 ℃、酶解时间119 min，预测番茄红素和多糖的得率分别为15.71 mg/100 g和77.78 mg/g。为了验证模型方程在最佳响应值方面的适用性，在最佳条件下进行3次提取工艺平行验证，提取得到的番茄红素和多糖的得率分别为15.69 mg/100 g和77.16 mg/g，RSD分别为0.13%和0.18%。实测值与预测值偏差率小于0.2%，表明该方程拟合较好。

3.5 番茄皮渣提取物的抗氧化活性对比

将酶辅助双水相提取法与传统溶剂提取法进行比较，传统溶剂法溶剂为90%乙醇，提取方法参照文献[17]，结果如表4所示。酶辅助双水相提取法番茄红素和多糖得率明显高于传统溶剂提取法，并且溶剂用量少，酶辅助双水相消耗溶剂量为传统溶剂提取的28.7%，提取温度较低，可避免高温对番茄红素结构的破坏。DPPH法抗氧化活性测定结果表明酶辅助双水相所得到的番茄红素比溶剂提取所得到的抗氧化能力较好，这可能是由于所得番茄红素分子发生几何异构化，使得DPPH自由基清除能力增强[18]。因此，酶辅助双水相法实现了番茄皮渣中番茄红素与多糖的同时提取与粗分离。