空间转录组概述和研究进展

廖成敏

（昆明理工大学，云南 昆明 650500）

人体组织是高度复杂的系统，由万亿个细胞组成，这些细胞在种类、时间和空间上有所不同，但它们相互协调，形成独特的微环境，以维持器官功能和处理信息，进而确定细胞类型。基于对人体器官分子基础的研究发现，哺乳动物器官转录异质性是由类型、状态、数量不同的细胞因发育（时间）和区域（空间）存在差异而造成的。

高通量单细胞转录组测序技术（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）通常用于鉴定细胞类型和推断发育轨迹等。scRNA-seq方法应用广泛，包括伪时态分析[1]、条形码标记细胞的起源[2]、以特定时间间隔连续采样[3]，可以揭示细胞命运、决定细胞谱系和发育轨迹。然而，scRNA-seq无法解决空间异质性的问题，基于微流控scRNA-seq技术，例如inDrop、Dropseq、microwell-seq和Split-seq等在组织消化后，细胞形成悬浮液，此时已丢失空间位置信息，无法将单细胞转录组信息与空间位置进行匹配。

因此，获取空间转录组信息是研究人员的长期目标，从早期尝试使用荧光原位杂交（Flourescence In Situ Hybridization，FISH）的方法[4]，到目前单细胞分辨率下的空间转录组检测[5]。最近，某学者使用了早先提出的一种RNA成像方法和FISH技术描绘了下丘脑视前区的空间分辨图谱[6]，发现下丘脑视前区覆盖了大约70个神经元簇，远远少于整个大脑。此外，同一群体内的细胞具有不同的分子特征，为了更好地了解细胞异质性，有必要同时记录它们的转录异质性和空间坐标。

1 空间转录组的主要优势

首先，空间转录组可以提供基因表达的“组织空间位置”信息，弥补单细胞转录组的最大缺点。其次，空间转录组实验只需要提供“组织切片”，但是单细胞转录组需要制备细胞悬浮液或“原生质体”，而在植物中，原生质体的获得非常困难。最后，空间转录组得到的空间位置信息可以作为细胞类群判定的一种注释信息，结合组织解剖学等知识，可以更快、更好地判断细胞所属类群，这在非模式物种的单细胞组学研究中具有很好的应用前景。

2 空间分辨转录学技术的研究进展

一般而言，现有的产生空间分辨转录本的方法可分为4类：

（1）利用计算机算法，根据单细胞转录组数据模拟重构组织的空间形态。例如Seurat是一个在单细胞数据分析中广泛用到的R包，可以利用scRNA-seq数据，加上对标志基因进行原位测序的结果重构组织的空间信息。

（2）激光显微切割加二代测序（LCM+NGS）。这种技术对仪器和实验人员的操作要求较高，而且获取的通量也比较低，如果组织非常珍贵或者研究的内容十分精细，可以考虑使用这种方法。但是这种方法因细胞通量低，应用较为困难。

（3）基于高分辨图像的原位测序。最经典的是smFISH，但这种方法的通量比较低。最近发布的FISH-seq技术通过多轮杂交的方式，已经把测序通量提高到了超过 10 000个转录本。

（4）基于空间条形码（spatial barcodes）的空间转录组技术，是目前的主流技术。以商业化的10x Genomics Ⅴisium为例，简述基于空间条形码的空间转录组工作流程。整个流程一共分为6步：第一，将冷冻组织切片，把切片放到芯片上。第二，用HE或者IF对组织切片进行染色，类似于“质控”，用来检验切片和贴片是否成功。第三，组织透化。在这一步中，向切片添加透化试剂，使得细胞的mRNA垂直向下释放到spot中，并与连有空间条形码的捕获极进行连接，然后通过被捕获的mRNA反转录形成cDNA。第四，去除组织切片，释放cDNA，进入测序文库构建。第五，测序，目前通常使用illumina二代测序。第六，数据分析，目前已经开发了很多成熟的分析包。

3 展望

虽然空间转录学在发现疾病因子、建立空间图谱和描绘空间蓝图方面得到了广泛的应用，但其潜力远不止于此。例如，在细胞间通信的研究中，从转录组数据和已知的配体-受体复合物中推断出不同细胞类型的上下信号串扰[7]。然而，单个细胞间正在进行的相互作用很难立即捕捉。无论是在组织中还是在培养环境中，紧密空间中的细胞更有可能相互作用，这正是空间转录技术的作用。空间转录组被引入细胞间通信的研究是有希望的。一些实验已经显示了缺血神经元的体细胞和轴突线粒体在单细胞尺度上的通信[8]。利用图像的方法（如seqFISH+、Merfish和Starmap）可以为观察单个细胞内的分子行为提供亚细胞视图，使分析基因-基因相互作用、基因调控网络和多模式组学成为可能[9]。研究表明，DNA变异与mRNA表达有关[10]，因此，同时检测处于原始坐标的分子可以加深人们对转录因子如何激活基因进行表达、基因如何相互沟通以及细胞如何运作的理解。突破这些瓶颈已成为下一个发展方向。

在这些障碍中，当前技术的主要挑战是从单细胞原位获得无偏向性的转录组，因为现有大多数基于实验的方法都是从靶向方法smFISH衍生出来的。SMR、SmHCR和osmFISH具有较高的检测效率和信号强度。相比之下，seqFISH+和Merfish可以从大量细胞中原位测量超过 10 000个mRNA，但它们不能准确检测新序列或小序列变体。FISH-seq是一种介于靶向性和无偏向性方法之间的折中解决方案，但这种方法效率低，难以在组织上实施，仅对较短的读数进行测序，无法准确检测变异体或新片段。基于LCM的方法，一旦突破了细胞通量低的瓶颈，就具有巨大的潜力，因为它们可以通过深度测序获得全基因覆盖的转录本。在计算机技术中，这些方法充分利用了来自scRNA-seq、原位杂交和已发表的现有数据来重建组织的空间转录。然而，细胞的实际坐标不能完全匹配，这些方法通常会简化建模过程以便于计算。因此，需要开发能够伴随高通量scRNA-seq的高空间分辨率的新技术。这些较为完善的技术的出现，将使它们在解决一系列生物学问题方面得到广泛的应用。