侵袭性念珠菌病耐药机制的研究进展

张伶玲 综述，刘泉波 审校

(重庆医科大学附属儿童医院感染科/儿童发育疾病研究教育部重点实验室/国家儿童健康与疾病临床医学研究中心/儿童发育重大疾病国家国际科技合作基地/儿童感染免疫重庆市重点实验室，重庆 400014)

真菌感染，尤其是念珠菌感染正在以惊人的速度迅速上涨。据估计，全球有超过500万种真菌，约有300种真菌可引起人类疾病[1]。侵袭性念珠菌病(IC)是住院患者最多见的真菌感染疾病。最新的全球报告估计，每年有75万多例IC病例，导致超过5万例死亡[2]。近些年，念珠菌感染的流行病学不断发生变化，非白色念珠菌感染逐渐增多，占许多地区IC的50%以上。我国一项对河北地区15家三级教学医院的研究表明，IC中非白色念珠菌检出比例已超过白色念珠菌，分别为58.21%和41.79%[3]，这与中国侵袭性真菌检测网(CHIF-NET)2010—2014年多中心侵袭性酵母菌感染的临床研究结果相似[4]。由于目前治疗侵袭性真菌感染疾病的药物种类少，耐多药念珠菌越来越多地被报道，这严重影响着人类健康。因此了解念珠菌的耐药现状及真正理解药物耐药性产生的分子机制对减少耐药性的发生至关重要。

1 念珠菌的耐药现状

与治疗细菌感染的抗生素类似，念珠菌属对抗真菌药物的耐药性严重威胁着公众健康。根据美国疾病控制和预防中心(CDC)2019年《抗生素耐药性威胁报告》，每年有超过34 000例病例，其中1 700例死于耐药念珠菌。丹麦的一项调查结果表明常见的念珠菌中，白色念珠菌对唑类药物的耐药率仅为0.4%，在近平滑念珠菌和热带念珠菌中接近6.0%，光滑念珠菌更是达到了9.1%[5]。而全球SENTRY监测项目指出，热带念珠菌对氟康唑这单一药物就达到了11.6%的耐药率，与光滑念珠菌的11.9%接近[6]。棘白菌素类药物的耐药性也不可小觑，美国一家医院的研究表明，10年时间光滑念珠菌对该药物的耐药率从4.9%上升至12.3%[7]，这远高于SENTRY报道的0～2.8%[6]。我国念珠菌耐药问题也越来越引人关注。CHIF-NET对国内多家医院的调查研究指出，2010—2014年白色念珠菌对唑类药物耐药率不足1.0%，而光滑念珠菌对氟康唑和伏立康唑的耐药率分别为19.0%和18.7%，热带念珠菌对2种药物的耐药率均达到了20.0%以上[8]。可见，无论国内还是国外，念珠菌耐药问题都较为严重，尤其是非白色念珠菌。

2 对唑类药物的耐药机制

2.1ERG11基因突变和过度表达 唑类药物的靶酶14-α脱甲基酶(ERG11p)，是麦角甾醇生物合成途径的关键酶。ERG11基因突变改变了ERG11p分子结构，使唑类药物无法与靶酶有效结合而发生耐药。已经证明ERG11的点突变，特别是发生在105～165、266～287和405～488氨基酸之间的3个“热点”区域，可以降低念珠菌对唑类药物的敏感性[9]。值得注意的是，突变位点的差异对不同唑类药物影响不同[10-11]。例如，酿酒酵母菌中Y140F/H的改变会显著降低短链唑类药物(氟康唑和伏立康唑)的活性，但不会影响长链唑类药物(伊曲康唑和泊沙康唑)的活性[11]。ERG11基因过度表达使14-α脱甲基酶增多，唑类药物不能与过多的靶酶结合，从而引起耐药性的产生。这一点在JIANG等[12]对热带念珠菌的研究中得以证明。但是关于ERG11基因的改变对不同念珠菌耐药性产生的影响仍需要更进一步的研究。

2.2药物外排泵的过度表达 药物外排泵是一种将细胞内药物转运到细胞外的特殊蛋白泵。外排泵编码基因的过度表达使跨膜转运蛋白增多，减少了胞内药物浓度而产生耐药。与念珠菌耐药相关的外排泵转运蛋白有2种，一种是利用三磷酸腺苷(ATP)水解作为能量来源的ABC转运蛋白家族，另一种是利用膜电位驱动外排的主要易化扩散载体家族。ABC转运蛋白Cdr1和Cdr2的过度表达常与白色念珠菌耐药有关，尤其是接受长期抗真菌治疗的患者[13]。除Cdr1和Cdr2外，Snq2转运蛋白在光滑念珠菌耐药性的产生中也起着重要作用[14]。与Cdr1和Cdr2同源的CkABC1和CkABC2也参与了克柔丝念珠菌对唑类药物耐药。GOHAR等[15]研究结果表明，ABC转运蛋白家族介导的药物外排，尤其是CgSnq2和CgCdr1在光滑念珠菌对氟康唑耐药性的产生中具有重要意义。属于主要易化扩散载体家族的转运蛋白Mdr1，参与了白色念珠菌、热带念珠菌和近平滑念珠菌对唑类药物的耐药，克柔丝念珠菌中还没有探索到耐药相关的转运蛋白[16]。DHA1亚家族转运蛋白CgAqr1、CgQdr2、CgTpo1和CgTpo3也与光滑念珠菌耐药有关[17]。因此，无论根据涉及耐药相关基因的数量或是临床耐药菌株中观察到的过度表达频率，ABC转运蛋白家族相关基因过度表达可能是念珠菌属耐药的主要机制。

2.3锌族转录因子突变 与念珠菌属耐药相关的锌族转录因子主要是UPC2、TAC1、MRR1及PDR1。UPC2调控ERG11基因的表达，其功能获得性(GOF)突变的发生会改变ERG11基因的转录水平，导致基因的过度表达及对药物的敏感性降低[18]。Cdr1及Cdr2表达量的多少与TAC1有关，研究证明，Cdr1可能是TAC1介导唑类药物耐药的主要原因[19]。而Mdr1基因的表达水平受到MRR1的调控，其GOF突变使靶基因的表达发生改变而参与耐药发生。已经证明Mdr1在氟康唑和伏立康唑耐药中起作用，尽管其对其他唑类抗真菌药物如伊曲康唑和泊沙康唑的最低抑菌浓度值变化不大[10]。存在于光滑念珠菌中的PDR1主要参与ABC转运蛋白基因CgCdr1、CgCdr2和CgSnq2的调节，CgPDR1的点突变会增加CgCdr1和CgCdr2的表达，与临床分离株对唑类药物的耐药息息相关[20]。

2.4改变代谢途径 麦角甾醇生物合成由25种不同的酶级联催化，合成途径中其他成分的改变如Δ-5,6-去饱和酶Erg3功能的丧失，也参与念珠菌对唑类药物的耐药。ERG3基因的失活使代谢通路发生改变，减少了毒性中间产物的产生，引起对不同唑类药物的相互耐药[21]。虽然该耐药机制较为罕见，但在临床菌株中已经观察到此现象。ERG相关基因的表达受到Upc2和Ndt80的调控。当破坏Upc2或Ndt80时，ERG11、ERG25、ERG6、ERG2、ERG3及ERG4的表达显著降低，并可以恢复对唑类药物的敏感性。与Upc2相比，Ndt80在近平滑念珠菌耐药性的产生中发挥的作用更强[22]。

2.5线粒体活性的改变 早期研究有报道线粒体缺陷引起的唑类药物耐药，这可能是减少了线粒体中ATP的产生和活性氧的种类[23]。CYTb基因编码线粒体氧化呼吸链中的细胞色素b，主要参与念珠菌属体内的氧化还原反应。FAN等[24]在对热带念珠菌耐药机制的研究中表明，唑类药物耐药组菌株CYTb基因的表达水平明显低于唑类药物敏感组菌株，提示CYTb基因表达水平的降低可能与热带念珠菌对唑类药物耐药具有一定的相关性。但先前JIANG 等[12]研究结果指出，唑类药物敏感组与耐药组CYTb基因的表达水平无明显差别，这表明线粒体活性的改变与唑类药物耐药相关性不大。因此，需要更多的研究证实两者间的关系。

3 对棘白菌素类的耐药机制

棘白菌素类药物以β-1,3-D-葡聚糖合酶为靶点，通过阻断葡聚糖的合成、破坏细胞壁结构的完整性，最终使细胞裂解死亡发挥抗真菌作用。其耐药性产生的主要机制是编码葡聚糖合酶催化亚基的基因(FKS1和FKS2)发生点突变，导致氨基酸的替换及由此产生的葡聚糖合酶结构的改变，从而降低了棘白菌素对葡聚糖合酶的敏感性[9,21]。其中FKS1点突变主要包括S629P、F625Δ和F625C，FKS2点突变主要包括F659Δ、S663F、R1378S、R1378G、S663P、P667H、P667T、E655G和E655K[25-26]，这一点在白色念珠菌及部分非白色念珠菌中均得以证实。适应性应激反应的启动也是棘白菌素耐药的潜在机制。体外研究表明，当棘白菌素类药物抑制葡聚糖合成时，念珠菌属会增加细胞壁其他成分如几丁质的合成，这种增加是由高渗透压甘油(HOG)途径、PKC-MAPK途径和钙调神经磷酸酶信号通路引起的[27]。Hsp90能够调节钙调神经磷酸酶和许多应激激活蛋白激酶的功能，抑制Hsp90可降低发生FKS1突变的临床分离株对棘白菌素的耐药性[28]。另外基因组可塑性也与棘白菌素耐药有关，这种可塑性可能会导致杂合子丢失、染色体拷贝数增加、非整倍体的形成等，但其背后的具体机制还需要进一步研究。

4 对多烯类的耐药机制

多烯类药物以细胞膜中的麦角甾醇为靶点，与甾醇相互作用导致细胞膜产生孔隙，从而使细胞内单价离子(如K+、Na+、H+和Cl-)快速外漏引起细胞崩解死亡。近几年，有研究强调多烯类药物可以直接结合并从细胞膜中提取麦角甾醇，阻止麦角固醇发挥其重要功能[29]。另外，多烯类药物还可以引起真菌细胞内活性氧的积累，诱导细胞凋亡[30]。多烯类药物的耐药性相对罕见，其耐药性产生的主要原因是细胞膜麦角固醇含量的降低或结构的改变，这可能与先前使用三唑类药物降低了膜麦角固醇的浓度或编码麦角固醇生物合成途径的相关基因(如ERG3、ERG6、ERG24和ERG2等)发生突变有关[31]。ERG3基因的错义突变还可以引起唑类药物与两性霉素B交叉耐药，这一点在热带念珠菌中已经得到证实。

5 对氟胞嘧啶的耐药机制

5-氟胞嘧啶可抑制真菌细胞核酸合成作用。其在胞嘧啶通透酶(由FCY2基因编码)的协助下主动转运到真菌细胞中，随后经胞嘧啶脱氨酶(由FCY1基因编码)转变为5-氟尿嘧啶。后者经尿嘧啶磷酸核糖转移酶(由FUR1基因编码)生成5-氟尿嘧啶单磷酸盐，通过抑制转录、DNA复制和蛋白质的合成发挥抗真菌作用。虽然氟胞嘧啶对大多数念珠菌具有很好的活性，但是此类药物在单药治疗期间容易产生耐药，限制了其在临床中的使用，因此主要与多烯类化合物联合应用治疗隐球菌性脑膜炎[1]。文献报道，念珠菌对氟胞嘧啶的耐药性与FCY1、FUR1、FCY2 基因突变有关[32-33],其中以FUR1基因突变最为常见。FUR1基因突变降低了5-氟胞嘧啶转化为具有细胞毒性代谢产物的能力，导致了耐药性的发生。

6 解决真菌耐药的策略

由于抗真菌药物种类有限，临床医生必须合理使用现有抗真菌药物，避免过早出现耐药。这需要临床医生掌握常用抗真菌药物特定的抗菌谱及药物在体内不同组织部位的浓度，由此选择合适的药物种类及剂量。了解所在地区及医院真菌的流行病学及耐药现状也具有重要指导意义。而积极寻找新的药物靶点、研发新型抗真菌药物也势在必行。一方面可以对原有的抗真菌药物进行化学修饰以提高其抗菌活性，另一方面可以开发新型结构的药物或寻找新的作用靶点。目前，已经研发的麦角甾醇生物合成抑制剂包括VT1129、VT1598和VT1161，它们高选择性地作用于真菌酶CYP51，而对人体细胞内相关酶没有抑制作用，显著降低了药物的毒性作用[34]。针对葡聚糖合酶这一靶点，已报道的包括具有代表性的长效棘白菌素类药物 CD101与三萜糖苷化合物SCY-078，后者是一种新型的口服抗真菌药物，填补了棘白菌素类药物只能静脉给药的空白[35-36]。作用于其他新靶点的药物也不断被挖掘，比如作用于真菌线粒体膜破坏氧化呼吸链的芳香酰胺类抗真菌药物T-2307[37]、抑制肌醇酰基转移酶破坏糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定蛋白合成的E1210[38]，以及选择性抑制嘧啶生物合成途径关键酶二氢乳清酸脱氢酶(DHODH)活性的F901318[39]，但这些药物大部分尚处于临床试验阶段，还需要进一步验证其安全性及临床可行性。另有研究表明，乙醛酸循环中的异柠檬酸裂合酶是真菌产生毒力所必需的，通过抑制该酶的活性可对不同真菌具有抑制作用，这为开辟新型抗真菌药物提供了思路[40]。此外，从中药成分中寻找有效抗真菌药物或增效剂也是一重要手段。坚信不久将涌现出更多值得深入研究的新型抗真菌药物，为临床治疗真菌感染提供更多可供选择的治疗方案。

7 小 结

综上所述，真菌耐药情况日趋严重，尽管抗真菌药物不断发展，但新型药物难以较快应用于临床。加上侵袭性念珠菌病抗感染疗程长，治疗过程中有可能使药物敏感性降低甚至产生耐药性，使得临床治疗失败。因此，在临床工作中应及早进行药敏试验并根据结果调整药物，最大限度地减少耐药菌株的产生。同时应加强对患者的管理及药物的监测以优化治疗效果和减少不良反应的产生。另外，应加强对念珠菌耐药机制深入了解，以提高现有抗真菌药物的疗效，积极寻找新的药物靶点以抑制耐药率的上升。