自由基在白血病干细胞衰老进程中的作用研究进展

李 渊 综述，顾守美，张素琴，王燏芳，毕玉洮，郭太兵，周 玥 审校

(1.大理护理职业学院，云南 大理 671006；2.大理大学第一附属医院呼吸内科，云南 大理 671000；3.大理大学组织胚胎学教研室/云南省细胞生物学重点实验室，云南 大理 671000)

白血病是血液系统的恶性肿瘤。白血病患者体内有大量的白血病细胞，这些具有极强克隆性的细胞浸入人体的骨髓和各个组织器官中大量增殖，抑制骨髓的正常造血，破坏组织和器官的功能。白血病是一种非常复杂的疾病，包括分子生物学发病机制及病因、多样性的临床症状、因人而异的个体化表现及病症、需不断调整和更新的治疗方案、难以预测的临床预后及复发风险等，都体现其复杂性。白血病细胞中存在的白血病干细胞(LSCs)是白血病发生、发展、复发、耐药的根本原因。在生物界中，衰老是物种的普遍规律，细胞作为生命个体最基本的结构和功能单位，在不断地进行新生、衰老和死亡，LSCs也摆脱不了衰老的命运[1]。人为地促进和诱导肿瘤细胞的衰老是治疗肿瘤的新观点[2]。在衰老的机制中，有自由基学说、遗传学说、免疫学说等，本文从自由基学说的角度综述LSCs的衰老，进而探究白血病的发生、发展。

1 LSCs生物学特性

对于LSCs的来源问题，目前没有完全统一的结论。有研究已证实，LSCs可能来源于以下4种途径：正常的造血干细胞、血液血管干细胞、已分化完成的造血祖细胞、基本成熟的白血病细胞[3-4]。急性髓系白血病中的LSCs均由正常的造血干细胞转化而来，其形成的结果是导致机体发生病态造血，从而造成一系列的贫血、感染、出血等恶性血液病症状。LSCs可能来源于已分化完成的造血祖细胞，融合基因MLL-AF9能够促进重置造血祖细胞的基因组，从而可能重新自我更新成为LSCs[5]。这类LSCs与正常的造血干细胞特性完全不同，其具有明显的肿瘤细胞特性，进而破坏正常造血功能促进白血病的发生[6]。LSCs也可能来源于血液血管干细胞和基本成熟的白血病细胞，这类LSCs的产生机制目前还不是很明确，需进一步证实。

与正常的造血干细胞比较，LSCs存在多种生物学特性，如独特的生存优势、更强的自我更新机制、特异的免疫表型、复杂的多重耐药机制特性等。LSCs可自主进入细胞周期，通过无限增殖和抗细胞凋亡以获得独特的生存优势和更强的自我更新机制；CD34、CD38、CD123、CD117、CD71、CD44、HLA-DR、TIM3、CLL-1、CD96、CD47、CD32和CD25等表面分子标志物，是LSCs特异的免疫表型；LSCs总是处在细胞周期之外的静止期，躲避化疗药物的杀伤，从而形成耐药性。LSCs有多种调控异常途径,目前发现与LSCs相关的信号通路包括WNT/β-catenin、PCGF4、JAK/STAT、PI3K/AKT、RAS、NF-κB、Notch等，因此从这些信号通路和基因入手，进行相应的靶向研究，可能会引发出新的临床治疗思路[7-9]。

2 LSCs衰老

衰老自概念形成以来就备受人们的关注，研究热度较高。就目前人们熟知的所有生物，衰老的基本过程是大体一致的。衰老是一个综合的、复杂的过程，其发生与机体的结构和功能退化相伴随[10]，其中就人类整体而言，普遍性、进行性、退化性和内因性是衰老的基本特征。随着生理、生化方面的理论不断革新，关于衰老机制也得到了更深层次的补充和完善。众多的衰老机制中，自由基学说一直被人们普遍关注和接受。

细胞衰老是指细胞在生命的进程中,随着机体的不断老化而出现的功能紊乱和分化增殖能力下降的过程。如此，LSCs的衰老也是一种渐进性的、伴发形态学改变的、不可逆性的退行性过程[11]。细胞衰老与细胞的形态改变相伴随，绝大部分衰老的细胞会出现细胞膜的通透性和流动性降低，染色质会逐渐呈现凝聚、固缩、碎裂、溶解的不可逆性过程，线粒体数量减少且功能退化，高尔基体形态消失，细胞核染色加深且形态增大，细胞质内脂类含量增多。衰老的细胞分子水平也发生变化：DNA的复制与转录在细胞衰老时均受抑制；RNA中mRNA和tRNA含量均降低；蛋白质的合成量、稳定性、抗原性、可消化性均下降；酶分子的二级结构、溶解度、等电点发生变化；不饱和脂肪酸被氧化，生物膜流动性下降。

3 自由基

自由基又称游离基,是指化合物的共价键发生龟裂而形成的未配对电子的原子或原子团。自由基是机体氧化反应过程中产生的中间代谢产物，具有高能的化学活性。人体内的自由基种类有很多，用来说明衰老发生机制的自由基主要是超氧阴离子自由基 (O2-)、羟自由基(·OH-)和类脂质过氧化氢自由基(H2O2)。它们具有强氧化的功能，存在于机体的各类生理和病理进程中，在机体的衰老进程中也发挥着重要作用。机体内的自由基不仅可以自我产生，也可以来源于外界。自由基对机体的作用是双重的，过多的自由基可使正常细胞结构和功能受损，甚至导致细胞死亡，完全清除自由基也会对机体造成损伤，少量的自由基可以发挥其杀灭微生物和促进基因突变适应环境的作用，平衡机体内氧化和抗氧化之间的关系。

4 自由基与LSCs衰老的关系

自由基含量的高低，直接影响了肿瘤干细胞的凋亡、分化、增殖与衰老。自由基含量增高，可抑制LSCs自我更新的生物学特性，进而抑制其增殖，且促进其分化、诱导其衰老及凋亡，导致LSCs减少；与已完全分化的白血病细胞相比，LSCs中的自由基含量更低，低含量的自由基对于维持LSCs的存活和特性尤为重要,自由基含量过高，极有可能诱发LSCs发生衰老，甚至死亡[12]。有研究证实：当归多糖可以调控CML骨髓间充质干细胞衰老，从而抑制LSCs的增殖，其可能的机制是提高细胞的抗氧化能力和降低细胞氧化损伤[13]。

4.1自由基引发端粒缩短 端粒的主要功能是维持机体染色体的完整性。细胞周期性的复制会引发端粒进行性缩短，端粒长度低于最低限度时，染色体的稳定性便被破坏，细胞此时虽然继续存活，但是已经不能进行正常的增殖分裂[14]。有研究已经表明，当归多糖能可通过p16INK4a/pRb信号通路在白血病小鼠体内有效抑制LSCs端粒酶的活性，从而破坏端粒的稳定性，导致端粒缩短，降低LSCs的自我更新能力，促进LSCs的衰老[15]。也有研究证实，40 μg/mL的当归多糖在体外作用CD34+CD38-LSCs 48 h后，细胞的端粒长度明显缩短，端粒酶活性明显下降，证实当归多糖在体外可通过调控端粒系统来诱导LSCs的衰老[16]。端粒酶活性调控着端粒的长度，自由基的过度增多使得端粒的功能发生障碍，长度进行性地缩短，破坏了LSCs染色体的稳定性，LSCs虽然存活，但是增殖受到抑制，出现衰老和凋亡的征象。

4.2自由基损伤线粒体 细胞内的线粒体具有调控细胞凋亡的重要作用[17]。故细胞线粒体若想充分全面地发挥其功能，完整无受损是对线粒体的基本要求。有文献报道，机体内的自由基大部分来源于线粒体，线粒体在产生能量的过程中可以释放大量的自由基，如自由基不能被及时清除，会导致mtDNA突变，进而影响线粒体的功能，使得线粒体产能减少，细胞发生死亡，机体出现衰老的征象[18]。有研究显示，POLG基因 (mtDNA 聚合酶γ)突变模型小鼠中，mtDNA 突变累积可导致模型小鼠出现衰老表型，同时小鼠的寿命大大缩短[19]。也有研究证实，mtDNA含量下降可致干细胞损耗,拓扑Ⅲα基因缺陷M1L系果蝇仅用短型(仅具有核定位信号，仅定位于细胞核)拓扑异构酶Ⅲα治疗可恢复生存能力，但细胞mtDNA含量下降,ATP水平也降低,致M1L系雄性果蝇生殖系干细胞进行性损耗并引起不育;而用长型(在N端保留线粒体导入序列，在C端保留核定位序列，主要定位于线粒体，但在细胞核中有一小部分)拓扑异构酶Ⅲα治疗则表型无明显异常[20]。ABRAHAM等[21]的研究发现，SIRT1在LSCs线粒体的氧化磷酸化中起着重要作用，与SIRT1基因未敲除的慢性髓系白血病小鼠相比，基因敲除的小鼠白血病症状延缓，即抑制SIRT1基因的表达，可降低LSCs线粒体的功能和活性，导致氧化磷酸化作用减弱，诱发LSCs发生衰老。SINGH等[22]的研究发现，LSCs的生长依赖于氧化代谢，通过抑制急性髓系LSCs中的线粒体膜间组装(MIA)途径，延缓了急性髓系白血病的发生，抑制了LSCs的自我更新，降低了LSCs的生存能力，诱发LSCs发生衰老。

4.3自由基诱发生物膜损伤 当体内自由基不断增多时，可引发膜上的脂类物质出现结构和功能的异常。生物膜由流动状态逐渐转化为刚性状态，胞内的细胞器功能也受损。当生物膜被破坏时，细胞的功能也会随之退化，诱发细胞衰老进程。ZHONG等[23]的研究发现，氧化固醇结合蛋白相关蛋白4L(ORP4L)是LSCs生存和生物能量所必需的蛋白，在正常的干细胞中不表达，但却在LSCs中高度表达，ORP4L蛋白能够从质膜中提取磷脂分子PIP2，并将其呈递给磷脂酶PLCβ3，从而产生第二信使IP3和Ca2+依赖生物能，维持LSCs的生存和能量生成；LYZ-81蛋白与ORP4L存在竞争性作用，可抑制LSCs的能量生成，降低其生存能力，促进LSCs的衰老。

4.4自由基促进细胞凋亡 细胞凋亡是细胞的一种程序性死亡过程。早期的研究发现，自由基过度增多可通过损伤DNA、影响信号传导，以及参与p53、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)和Bax等凋亡基因表达调控等途径介导细胞凋亡[24]。干细胞因拥有稳定的端粒酶，有效消除了端粒缩短的问题，而具有更强的自我更新特性；还可通过旁分泌效应，分泌血管内皮生长因子、白血病抑制因子(LIF)、SDF等趋化因子、Bcl-2基因等抑制凋亡因子，从而抑制干细胞发生凋亡。王东萍等[25]的研究发现，秦巴硒菇的提取物FA-2-b-β可通过增强Bax和Caspase-3的表达来抑制KG1a干细胞增殖，诱导其凋亡，其抗肿瘤效应是通过调控线粒体介导的凋亡途径来实现的。周勇等[26]的研究发现，抗酗酒药Disulfiram联合铜通过上调肿瘤坏死因子-α表达诱导活性氧蓄积，促进LSCs凋亡。

4.5自由基造成DNA损伤 过量的自由基可使碱基完整性被破坏，诱发机体的染色体出现变异，基因出现突变。被损伤的基因片段不能及时被修复，导致基因中转录的mRNA减少，蛋白质表达减少，细胞功能减退，加速衰老的发生，导致机体出现肌肉萎缩、智力减退、记忆力障碍等衰老的表征。罗堉暄等[27]的研究证实，STAT3抑制剂Stattic可能通过诱导白血病细胞发生DNA损伤并阻碍其修复，进而促进细胞凋亡，加速LSCs的衰老进程。PODSZYWALOW-BARTNICKA等[28]的研究发现，可以通过抑制CML白血病小鼠模型中的RAD52基因表达，进而阻止CML的进程。有科研人员将RAD52蛋白敲除后，LSCs的DNA出现结合修复双链断裂而发生衰老死亡[29]。CIMMINO等[30]的研究发现，维生素C联合PARP抑制剂可以使TET2突变的LSCs DNA发生去甲基化，降低其自我更新的特性，发生衰老和死亡。

5 小 结

以上研究证明，自由基与LSCs的衰老有着密切联系。不断深入探究LSCs衰老与自由基之间的关系，不仅有重要的理论意义，也有广泛的发展前景。在机制研究方面，可以更加多元化认知LSCs的衰老机制，更深层次地理解衰老的过程，完善了LSCs衰老方面的知识框架，为开发出新型抗衰老、抗白血病发生的药物提供了新思路和理论模型。在临床治疗方面，可以为白血病的预防、防治及预后开拓新的治疗思路，有效降低白血病的发生率，延缓白血病的进展，减轻白血病患者的症状。综上所述，通过控制自由基的含量，进而从基因分子水平来调控LSCs的凋亡和衰老，是未来治疗白血病的一种新思路。自由基可以调控LSCs的衰老，但对于其他肿瘤及肿瘤干细胞是否也有调控作用尚不清楚。虽然现在关于LSCs衰老与自由基的关系这方面的机制和研究还不是很深入，但为后期研究白血病的发生机制及治疗方案提供了有力的理论依据。