UFLC-Q-TOF-MS/MS结合指纹图谱定性评价菝葜(金刚藤)药材质量的研究

龙丽，冯海兴，王灿茂，杨琴，吴馥凌，侯连兵

(南方医科大学南方医院，广东 广州 510515)

菝葜(SmilaxchinaL.)又名金刚藤，是百合科植物菝葜的干燥根茎，主要分布于长江以南的多个省份。中医学认为菝葜性味甘、微苦、涩、平，具有利湿去浊、祛风除痹、解毒散瘀的功效[1]。以菝葜药材为原料药的制剂在临床上应用广泛且疗效确切，如金刚藤软胶囊(国药准字Z20070006)[2]，主治慢性盆腔炎、附件炎、子宫内膜炎等炎症性疾病[3]。目前，菝葜药材仍缺乏有效的质量控制方法，2015年版《中国药典》未收载其制剂。而在指纹图谱方面，周艳林等[4]分别对菝葜药材脂溶性成分和黄酮类成分运用 HPLC 指纹图谱进行了分析。杨立勇等[5]对贵州产菝葜及其混淆品光叶菝葜的指纹图谱进行了综合分析比较。徐贝等[6]则以湘产菝葜为研究对象进行HPLC指纹图谱分析。但金刚藤胶囊的原料药的质量控制还是很难推进。结合本课题组前期研究[7-8]和菝葜与抗盆腔炎大鼠谱效学研究[9]表明：菝葜药材的总黄酮成分是潜在的药效成分。为此，本研究采用HPLC法建立了菝葜药材指纹图谱，并对菝葜药材进行聚类分析，以期发现菝葜药材中总黄酮成分含量较高的产地，为其制剂原料药的质量控制提供实验依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Ultimate 3000 DGLC高效液相色谱仪(美国Dionex公司，LPG-3400SD四元泵、TCC3000-RS柱温箱、WPS-3000SL自动进样器、DAD检测器、Chromeleon7.2数据处理软件)；Agilent 1260 高效液相色谱仪(G1311B四元泵、G1316A柱温箱、G1315DDAD检测器、G1329B进样器)；UFLC-Triple TOF-MS/MS超快速高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱仪(LC-20AD-XR二元泵，CTO-20A柱温箱，SIL-20AD-XR自动进样器，SPD-M20A PDA 检测器，日本岛津公司；Triple TOF 5600 plus，美国 AB SCIEX公司)；中药粉碎机(DMF-8A，浙江温岭市铭大药材机械设备有限公司)；超纯水器(Simplicity，美国Millipore公司)；万分之一电子分析天平(ME204，瑞士Mettlertoledo公司)；数控超声波清洗器(KQ500DE，昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 材料

甲醇(分析纯，广州化学试剂厂，批号：2019010128)；乙腈(色谱纯，Honeywell，批号：UN1648)；磷酸(色谱纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号：P112025)；水为超纯水。

黄杞苷对照品(批号：11906-201102，纯度：93.7%)、槲皮苷对照品(批号：111538-201606，纯度：90.6%)(中国食品药品检定研究院)；落新妇苷对照品(批号：A102725，纯度：98%)(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；异黄杞苷对照品(批号：B24735，纯度：95%)(上海源叶生物科技有限公司)。

实验用20批菝葜药材均购买于广州市清平中药材专业市场，并经中山大学生命科学院廖文波教授鉴定为百合科植物菝葜(SmilaxchinaL.)的干燥根茎。药材来源见表1。

表1 20批菝葜药材来源信息

2 方法与结果

2.1 供试品的制备

精密称取菝葜药材粉末(过2号筛)0.5 g，置于锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定重量，超声(100 W，100 Hz)处理30 min，放冷，称重，用甲醇补足减失的重量。取上清液，用0.22 μm微孔滤膜过滤，续滤液作为供试品溶液。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取落新妇苷、槲皮苷、黄杞苷和异黄杞苷对照品适量，加甲醇制成对照品储备液，浓度依次为122.6、55.0、502.4和85.0 μg/mL。

2.3 色谱条件

色谱柱：Hitachi High-Tech C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相：乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)梯度洗脱(0 min～18 min，10% A；18 min～120 min，10%～30% A)，检测波长：303 nm，进样量：10 μL，体积流量：1.0 mL/min，柱温：30 ℃。理论板数按落新妇苷计算不得低于5000。采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)》评价其相似度。

2.4 方法学考察

2.4.1 专属性试验

取“2.1”项下菝葜药材供试品溶液(样品编号：S3)、空白溶剂(甲醇)、对照品溶液，分别进样，用相同的色谱条件进行分析。结果表明专属性良好，见图1。

注：A：空白对照；B：混合对照品；C：菝葜供试品；8：落新妇苷；12：槲皮苷；13：黄杞苷；15：异黄杞苷。图1 空白对照、混合对照品和菝葜药材供试品的HPLC图谱

2.4.2 精密度试验

取同一批菝葜药材(样品编号：S3)，精密称定，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件，连续进样6次，记录 HPLC 色谱图。根据对照品确认8、12、13、15号峰依次为落新妇苷、槲皮苷、黄杞苷和异黄杞苷。其中13号峰面积大，且稳定，设为参照峰，计算其他3个峰的相对保留时间与相对峰面积。结果显示：相对保留时间RSD在0.02%～0.08%之间，相对峰面积RSD在0.14%～2.05%之间，相似度均等于1.00。结果表明仪器的精密度良好。

2.4.3 稳定性试验

精密称取同一批菝葜药材(样品编号：S3)，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件，分别在0、2、4、8、12、24、48、72、120 h 进样，记录 HPLC 色谱图。结果显示：相对保留时间RSD在0.02%～0.09%之间，相对峰面积RSD在0.25%～1.09%之间，相似度均等于1.00。结果表明供试品溶液放置120 h 内稳定。

2.4.4 重复性试验

取同一批菝葜药材(样品编号：S3)，精密称定，按“2.1”项下方法分别制备6份供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件分别进样，记录 HPLC 色图谱。结果显示：相对保留时间RSD在0.01%～0.04%之间，相对峰面积RSD在1.90%～3.54%之间，相似度均等于1.00。结果表明方法重复性好。

2.4.5 耐用性试验

取同一批菝葜药材(样品编号：S3)，精密称定，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，分别使用Hitachi High-Tech C18(4.6 mm×250 mm，5 μm，No.28H5I-019)、Thermo C18(4.6 mm×250 mm，5 μm，No.01705069)、SEPAX Amethyst C18(4.6 mm×250 mm，5 μm，S.N.11041698382)3种型号色谱柱，按“2.3”项下色谱条件进样，记录色谱图。结果显示：相对保留时间RSD在0.23%～0.64%之间，相对峰面积RSD在1.93%～3.54%之间，相似度均等于1.00，表明方法重复性好。

2.5 菝葜药材指纹图谱的构建

2.5.1 指纹图谱的获得

取表1中的菝葜药材按“2.1”项下方法处理，按“2.3”项下色谱条件分别进样，记录各色谱图。各批次样品叠加图结果见图2。

图2 20批菝葜药材HPLC指纹图谱

2.5.2 共有峰和参照峰的确认

分析20批菝葜样品的测定结果，获得19个共有峰(若某一图谱在某一保留时间处无峰，相应的峰面积为零，仍给相应的编号，以保证各图谱都有相同的色谱峰数)，见图3和表3。因8号和13号峰稳定性好、分离度好且具有良好的抗炎活性[7,9]，故选择该峰为参照峰。

图3 不同批次菝葜药材指纹图谱共有模式

2.6 共有峰的确证

2.6.1 测定法

通过超快速高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱(UFLC-Triple TOF-MS/MS)技术对“2.1”及“2.2”项下菝葜供试品溶液(样品编号：S3)、对照品溶液、空白溶剂进行检测，色谱条件同“2.3”项下，分流进样。质谱条件：ESI电喷雾离子源，离子源喷雾电压：5 500 V，离子源气体压力：255 psi，离子源气体：155 psi，离子源温度：550 ℃，碰撞气压力：10 psi，气帘气压力：35 psi，扫描范围：m/z 50～2 000，采用正、负离子模式进行检测。

2.6.2 共有峰的确证

检测结果通过与碎片离子分析、保留时间、对照品对照及文献查阅[10-19]，指认并确证菝葜药材指纹图谱中共有峰所对应的化合物。结果见表3。

表2 菝葜药材19个色谱峰的相对峰面积

表3 菝葜药材的化学成分质谱归属

续表3

2.7 菝葜药材的聚类分析

采用IBM SPSS Statistics 24.0数据统计软件，将20批菝葜样品的19个共有峰的相对峰面积导入，使用瓦尔德聚类方法，用欧式平方距离计算样品相似度，聚类结果见图4。由聚类分析图可见：当欧式平方距离为8时，可将20批菝葜样品聚为3类。S12、S15、S16、S17、S19聚为第一类；S2、S5、S8、S10、S18、S20聚为第二类；S1、S3、S4、S6、S7、S9、S11、S13、S14聚为第三类。结合表2和表3可知，第一类的产地均为云南，且成分以8号峰落新妇苷为主，平均相对峰面积在48%左右；第二类的6批菝葜药材中1、2号峰(有机酸类)相对峰面积较高；第三类的9批菝葜药材中14、18、19号峰(芪类和皂苷类)相对峰面积较高。

图4 20批菝葜样品的聚类分析图谱

3 讨论

中药指纹图谱是从中药成分群角度出发的一种客观、整体和多指标的质量评价方式，已被广泛应用于中药的质量控制评价[20-21]。本研究考察了柱温对指纹图谱的影响，发现30 ℃时各色谱峰形较好；采用DAD检测器考察了各色谱峰的紫外光谱对指纹图谱的影响，发现大部分化合物在290～320 nm处有较大吸收，故确定指纹图谱的检测波长为303 nm。

本研究构建了全国12个不同产地共20批次菝葜药材的HPLC指纹图谱，通过UFLC-Triple TOF-MS/MS技术指认了19个共有峰，并确证了其中17个成分(见表3)，以有机酸类、黄酮类和皂苷类成分为主。因为药材产地来源的不同，在研究中发现各共有峰的相似度较小(<0.9)，说明菝葜药材化合物成分含量受地理环境、气候影响较大。根据各产地菝葜药材聚类分析结果发现：云南产地的菝葜药材总黄酮化合物含量较高(落新妇苷、槲皮苷、黄杞苷和异黄杞苷总峰面积占比约为64.90%)，且黄酮类化合物中以落新妇苷含量最高(平均峰面积约占48.53%)。而贵州产地的有机酸含量较高(平均相对峰面积约占44.93%)。这为菝葜制剂原生药材产地的筛选提供实验依据。

综上所述，此研究建立了菝葜药材HPLC指纹图谱分析方法。该方法准确度和精密度高，易于操作，适用性强。可为菝葜药材的质量控制评价提供新方法，也为菝葜药材的物质研究究奠定基础。