禽饲料中5种聚醚类抗球虫药物检测方法研究

杨 露，谭会泽，刘松柏，陈 丹，余军军

(温氏食品集团股份有限公司//农业部动物营养与饲料学重点实验室，广东 云浮 527400)

球虫病是由寄生于宿主肠道或胆管上皮细胞内的艾美耳科原虫引起的家禽常见且危害严重的寄生虫病。球虫病造成的经济损失是巨大的，目前国内外对鸡球虫病的防治主要是依靠聚醚类抗球虫药物，如甲基盐霉素(NAR)、盐霉素(SAL)、莫能菌素(MON)、拉沙洛西钠(LAS)、马杜霉素(MAD)等。这些聚醚类药物是20世纪70年代出现的一类离子载体抗生素，它们在化学结构和性质上非常相似，大多都含有一个一元有机酸和许多醚基，因而可形成多种金属盐。聚醚类抗球虫药经常以钠盐、钾盐或铵盐的形式存在，微溶或不溶于水，易溶于低级醇、丙酮、氯仿、苯、乙醚、石油醚、乙酸乙酯、四氯化碳及正己烷等，且在中性或碱性环境中稳定。它们能与球虫细胞中的阳离子紧密结合，改变细胞膜上脂质屏障的渗透性，使细胞内外离子浓度发生变化，导致大量水分进入球虫细胞，最终使球虫肿胀死亡[1]。

目前，国内外关于莫能菌素、盐霉素、甲基盐霉素、拉沙洛西钠和马杜霉素的检测方法，主要为微生物法、免疫学分析法、光谱法、色谱法、色谱质谱联用分析法等[2]。本研究是利用液相色谱-串联质谱法摸索测定饲料中5种聚醚类抗球虫药的检测方法，优化目前已有的液相色谱条件和化合物质谱条件，使其灵敏度更高、重现性更好，结果更加准确，能更好的满足禽用饲料中聚醚类抗球虫药物的检测。

1 方法原理

试料中的聚醚类抗球虫药物经乙腈提取，然后硅胶固相萃取柱净化后，备用液用液相色谱-串联质谱仪测定，外标法定量。

2 材料与方法

2.1 试剂

甲醇、乙腈、甲酸试剂，色谱纯；正己烷-乙醚(50+50)；二氯甲烷-甲醇(90+10)；聚醚类抗球虫药标准溶液等。

2.2 仪器

液相色谱-串联质谱仪(配有电喷雾电离源ESI)，涡动仪；离心机，分析天平，硅胶固相萃取柱(500 mg/(6 ml))，水浴氮吹仪，0.22 μm有机滤膜。

2.3 仪器条件

2.3.1液相色谱条件

液相色谱条件见表1。

表1 液相色谱条件

色谱柱：BEH C18柱，100 mm×2.1 μm(i.d.)，粒径1.7 μm。柱温：50℃。

流动相：甲醇(含0.1%甲酸)-0.1%甲酸(97+3)。流速：0.3 ml/min。进样体积：10 μl。

2.3.2质谱条件

质谱条件见表2。

表2 聚醚类药物测定的质谱条件

扫描方式：正离子扫描。

检测方式：多反应检测(MRM)。

电喷雾毛细管电压：2.8 kV。

取样锥孔电压：1.0 V。

透镜电压：0.5 V。

离子源温度：80℃。

去溶剂温度：300℃。

倍增器电压：650 V。

二级碰撞气：氩气。

2.4 标准曲线制作

2.4.1标准品来源

盐霉素、拉沙洛西钠、莫能菌素、甲基盐霉素和马杜霉素(纯度均≥95%)由国家标准物质中心提供。

2.4.2不同浓度混合标准液

单个聚醚类标准液(1 000 μg/ml)：分别准确称取盐霉素、拉沙洛西钠、莫能菌素、甲基盐霉素和马杜霉素标准品10 mg，用甲醇分别溶解并定容10 ml容量瓶中，制成1 000 μg/ml的单个聚醚类抗球虫药标准液。-20℃保存，有效期为12个月。

5种聚醚类混合标准液(100 μg/ml)：分别准确量取适量5种1 000 μg/ml单个聚醚类标准溶液于同一容量瓶中，用甲醇稀释成100 μg/ml的混合标准液。-20℃保存，有效期6个月。

5种聚醚类混合标准液(10 μg/ml)：准确量取适量100 μg/ml聚醚类混合标准溶液于容量瓶中，用甲醇稀释成10 μg/ml的混合标准液。-20℃保存，有效期6个月。

5种聚醚类药物混合标准工作液：量取适量10 μg/ml聚醚类药物混合标准液，用甲醇(含0.1%甲酸)依次稀释成浓度为1、2、10、20、100、200 ng/ml的标准工作液，现配现用。

2.5 样品前处理

2.5.1提取

称取试样2 g(精确到0.01 g)于50 ml离心管中，加20 ml乙腈，振荡提取30 min，2 000 r/min 4℃条件下离心5 min，取上清液至离心管。残渣用20 ml乙腈重复提取一次，合并2次上清液。将提取液于鸡心瓶，40℃旋蒸至干，用3 ml正己烷溶解残渣，转移至10 ml离心管。再用2 ml正己烷洗涤鸡心瓶，合并2次溶解液，3 500 r/min离心5 min，上清液备用。

2.5.2净化

取硅胶固相萃取柱，加5 ml正己烷预洗，将上述得到的上清液过萃取柱，加乙醚-正己烷(50/50)8 ml洗涤，抽干，加二氯甲烷-甲醇(90/10)6 ml洗脱，收集洗脱液，40℃下氮气吹干，甲醇(含0.1%甲酸)1.0 ml溶解残渣，过0.22 μm滤膜后上液相色谱-串联质谱仪分析[3]。

2.5.3基质标准曲线的制备

精密量取标准工作液，用甲醇(含0.1%甲酸)溶液稀释成1.0、2.0、10.0、20.0、100、200 ng/ml的工作溶液。将5个饲料空白样品按样品提取净化步骤处理，氮气吹干后，用上述标准工作液溶解后上机测定，将各抗球虫药物定量离子峰面积与其响应浓度进行线性回归，得到基质标准的工作曲线以及各组织中的线性回归方程和相关系数，详情见表3。

2.5.4回收率

在禽用配合饲料空白样品中分别添加25、125 ng/ml两种不同浓度的聚醚类抗球虫药进行回收率试验，每个浓度5个平行，连续做3 d，分别求得回收率、日内变异系数和日间变异系数，结果见表4。

3 结果与分析

3.1 基质匹配加标校准曲线

从检测结果看，5种聚醚类抗球虫药的线性条件都较好，相关系数均大于0.995。这证明5种聚醚类抗球虫药物在浓度1～200 ng/ml的范围内呈线性相关关系。

3.2 添加回收率测定

在禽用配合饲料空白样品中分别添加25、125 ng/ml两种不同浓度的聚醚类抗球虫药进行回收率试验，结果如表4所示。

表4 5种聚醚类药物的添加回收率试验结果

从检测结果看，5种聚醚类抗球虫药检测的日内变异系数均小于10%，日间变异系数也均小于10%。对于药物测定的方法回收率偏差范围，据GB/T 27404—2008的附录F.1中要求，新建立的方法回收率在要求范围内。而且按照农业部1862号公告:4—2012《饲料中5种聚醚类药物的测定液相色谱-串联质谱法》中要求：在重复条件下完成的2个平行测定结果的相对偏差不大于15%，检测结果表明该方法满足条件。

4 结论

利用液相色谱-串联质谱法检测快速、定性定量准确、回收率较高，解决了长期以来禽用饲料中聚醚类药物残留检测中常常遇到的杂质干扰和基质效应等问题，完全满足对建立禽用饲料中5种聚醚类药物残留检测方法的要求。