SLC7A2作为肝细胞癌新的生物标志物研究

母波，赵春艳，胡先华，张人丹

(川北医学院，1.基础医学院；2.四川省医学影像重点实验室，四川 南充 637000)

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)占原发性肝细胞癌的90%[1]，是世界上第四大癌症死亡原因[2-3]。虽然肝细胞癌的预防、早期诊断和综合治疗已经取得了较大进展，但术后复发率很高，预后不良仍然是肝细胞癌临床面临的重大难题[4]。因此，急需进一步探讨肝细胞癌分子生物学特征和发病机制。L-精氨酸是一种半必需氨基酸，是蛋白质生物合成的底物以及一氧化氮和多胺的前体，其在调节细胞增殖和分化中起着至关重要的作用[5-6]。有研究[7-8]表明，L-精氨酸与肿瘤的发生和发展有关。溶质载体家族7成员2(SLC7A2，也称为CAT2)是半必需氨基酸L-精氨酸(L-Arg)的诱导型转运蛋白[9]。Coburn等[10]研究表明，SLC7A2在调节结肠炎相关癌变(CAC)的乙氧基甲烷(AOM)-DSS模型中结肠肿瘤发生中起作用。SLC7A2在慢性结肠炎的发生中对CAC的保护具有重要作用，并表明炎症性肠病(IBD)中SLC7A2的减少可能会导致CAC风险[11]。Kesavardhana等[12]通过分析预后良好与不良的患者的基因表达谱，确定了SLC7A2基因的表达与乳腺癌患者具有较为明显的生存优势相关；并基于回归分析进一步建立了SLC7A2作为一种新型的乳腺癌独立预后生物标志物。这些发现提示SLC7A2可能在肿瘤发生中起关键作用。然而，SLC7A2的表达水平及其在HCC中的作用尚不清楚。本研究通过综合生物信息学分析确定SLC7A2在HCC和正常人群表达差异，并探讨其在HCC中的临床意义。

1 材料和方法

1.1 癌症基因组图谱(TCGA)数据库中的生物信息学分析

从TCGA-LIHC数据集检索377个原发性肝细胞癌组织和50个正常对照的3级数据，如mRNA-seq数据、甲基化数据和临床数据。筛选掉无完整的特异性TNM分期和生存数据，369例接受肝切除术的患者被纳入本研究，其中364例HCC患者具有完整的mRNA、CNA和甲基化数据，SLC7A2表达与临床相关性分析根据OS的最佳阈值入组患者为339例。原始计数数据的归一化和正常对照与HCC组织之间差异表达基因的鉴定采用R(R3.6.3)语言进行分析，设定P<0.05和|log2|>1定义为阈值。TCGA数据集中33种肿瘤组织的SLC7A2 mRNA表达水平采用GEPIA[13]进行综合分析。SLC7A2 DNA甲基化、拷贝数改变(copy number alterations，CNA)则利用cBioPortal[14]进行研究。

1.2 统计学分析

采用SPSS 22.0和R版3.6.3进行统计分析。用t检验评估不同临床病理组SLC7A2的表达。SLC7A2在HCC中的诊断价值采用ROC曲线判断，并计算曲线下面积(AUC)。生存数据(死亡或复发)利用R版本3.6.3计算最优阈值，将基因表达水平分为低表达和高表达组。SLC7A2表达与临床病理参数的相关性用χ2评估。低表达组和高表达组之间的总生存率(overall survival，OS)和无病期间(disease free interval，DFI)通过Kaplan-Meier(K-M)分析和对数秩检验比较。HCC的OS或DFI相关的独立指标利用Cox模型确定和列线图进行评价，并计算95%置信区间(CI)和危险比(HR)。通过线性回归分析评价SLC7A2 mRNA表达与SLC7A2 DNA甲基化水平的相关性。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 SLC7A2在HCC组织中表达下调

SLC7A2在正常人体组织和肿瘤组织中的表达发现，包括肝细胞癌组织在内，多数肿瘤中SLC7A2表达下调(图1 A-B)。ROC曲线显示SLC7A2下调对HCC具有显著的诊断价值(图1C)。

2.2 SLC7A2低表达与肝细胞癌肿瘤进展密切相关

根据OS的最佳阈值将入组的患者(n=339)分割成低或高SLC7A2表达组，以研究SLC7A2表达的临床意义。 两组患者在年龄、性别、癌症家族史、肿瘤TNM分期、低分化肿瘤、Ishak评分和Child-Pugh分级等方面比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。 然而，SLC7A2低表达与血清甲胎蛋白(AFP)阳性、血管侵犯、残余肿瘤、复发和死亡显著相关(P<0.05)。见表1。

2.3 Cox模型证明HCC中SLC7A2表达的预后价值

为评估SLC7A2低表达对于肝细胞癌患者是否具有预后判断价值，首先根据最优阈值生成KM曲线，评估SLC7A2表达在HCC中与OS和DFI之间的关系。 结果显示SLC7A2低表达与HCC患者OS具有统计学差异(P=0.006)，而与DFI没有统计学意义(P=0.09)(图1D-E)。Cox回归分析显示在单因素模型中，HCC中血管侵犯、TNM分期中，SLC7A2低表达与OS显著相关(P<0.05)；多因素分析显示，SLC7A2低表达也仅与HCC的OS具有相关性(HR=0.89，95%CI=0.8～0.99，P=0.032)，而与DFI无相关(HR=0.95，95%CI=0.86～1.06，P=0.348)(表2、表3)。 SLC7A2的低表达在HCC不同TNM分期，仍然仅与HCC 的OS相关性显著(P<0.05)，而与DFI不相关(P>0.05)。见图2。

表1 肝细胞癌患者SLC7A2基因表达的临床相关性[n(%)]

表2 Cox危险回归模型预测SLC7A2表达与HCC DFI临床相关性

表3 Cox比例回归模型预测SLC7A2表达与HCC OS临床相关性

2.4 列线图模型证明HCC中SLC7A2表达的预后价值

用于OS预测的基因组-临床病理模型的CI指数为0.638(95% CI=0.609～0.667)，用于DFI预测的基因组-临床列线图的CI指数为0.641(95% CI=0.616～0.666)。见图3。

2.5 HCC中SLC7A2的表达下调基于DNA拷贝缺失和SLC7A2甲基化减少

在TCGA-LIHC数据集中具有完整的mRNA、CNA和甲基化数据(n=364)的HCC患者中，26例(7.14%)有SLC7A2拷贝数深度缺失，224例(61.53%)有SLC7A2拷贝数低水平缺失，SLC7A2拷贝缺失与SLC7A2m RNA低表达显著相关(P<0.05)(图4A)。线性回归分析表明，SLC7A2m RNA表达与其总DNA甲基化水平(Pearson’s R=-0.27，P<0.001)具有明显的相关性(图4B)。

3 讨论

近年来，随着遗传学和分子生物学的迅速发展，HCC的早期发现和更个性化的肿瘤治疗得到了发展，其中关键生物标志物的识别是至关重要的一步[15]。 SLC7A2已被证实在多种肿瘤中下调，可作为结肠癌和乳腺癌的生物标志[11-12，16]。 然而，SLC7A2的表达水平及其在HCC中的作用和临床意义尚未被研究。本研究发现与正常肝组织中相比，肝细胞癌组织中SLC7A2 mRNA水平上明显下调，且通过ROC曲线评估，其对HCC具有良好的诊断价值，提示SLC7A2可能是一种有益于HCC分子和病理诊断的有前途的生物标志物。同时发现SLC7A2的低表达与血清AFP阴性、血管浸润、复发和死亡有关，表明SLC7A2可能与HCC的肿瘤发生和进展有关(P<0.05)。KM分析表明，SLC7A2低表达的HCC患者OS相对更差(P<0.05)，而DFI差异不具有显著性(P>0.05)。多指标COX分析也证实SLC7A2低表达是HCC 的OS不利独立指标。

目前，考虑到个别HCC患者预后的显著异质性，TNM分期系统的预后作用不够精确，建立基因组-临床-病理列线图来预测术后患者的长期预后是非常必要的[4]。与TNM分期系统相比，基因组-临床病理列线图代表了更精确的预后模型。本研究中基于SLC7A2mRNA表达和TNM分期构建的列线图模型预测结果表明，SLC7A2有望作为一个有价值的预后因素，以改善肝细胞癌患者临床决策的术后监测(生存和复发)，并可成为一种额外的治疗手段。血清生物标志物具有相对缺乏的敏感性和特异性[17]。本研究HCC组织中SLC7A2的下调与血清AFP表达水平显著相关。因此，确定HCC患者血清SLC7A2的表达水平，评价血清SLC7A2在HCC中的独立或联合(如AFP和GP73)诊断和评估预后价值，用于早期无创筛查和早期发现HCC术后复发，可能具有较为重要意义。

为研究HCC中SLC7A2低表达的原因，本研究从DNA缺失和表观遗传改变的角度探讨了HCC中SLC7A2下调的潜在机制。观察到在具有完整的mRNA、CNA和甲基化数据HCC患者中(n=364)，有250例(68.67%)HCC患者 SLC7A2具有低水平(n=224，61.53%)或高水平(n=26，7.14%)的DNA缺失，这与SLC7A2表达降低显著相关。大量研究[18-20]显示DNA甲基化异常与各种恶性肿瘤的染色体不稳定和基因下调密切相关。本研究发现SLC7A2mRNA表达与其在HCC中的DNA甲基化水平之间存在显著的相关性(P<0.001)。提示遗传(DNA拷贝缺失)和表观遗传(DNA甲基化减少)的改变都有助于肝细胞癌SLC7A2的表达降低。

综上所述，与正常肝组织相比，SLC7A2在HCC组织中的表达显著下调，可能是由于SLC7A2 DNA拷贝缺失和低甲基化所致。此外，SLC7A2的低表达与HCC的进展关系密切，并可独立预测肝细胞癌患者的不良OS。然而，SLC7A2表达所涉及到的信号通路以及在HCC中的确切作用机制，需要更深入研究来进一步阐明。