KRAS基因突变类型预测结肠直肠癌根治术后异时性远处转移

林松斌，冯青阳，许剑民

（1.复旦大学附属中山医院厦门医院普外科，福建 厦门 361000；2.复旦大学附属中山医院普外科，上海 200032）

结肠直肠癌是世界常见的恶性肿瘤[1]。在我国，结肠直肠癌发病率与死亡率逐年上升，均位居恶性肿瘤第5位，正逐步接近发达国家[2-3]。远处转移是结肠直肠癌病人死亡的主要原因。对于初诊无转移的结肠直肠癌病人，行原发灶根治术后，10%～25%的病人出现异时性远处转移[4-5]。手术是治疗异时性远处转移的最佳手段，早期发现是达成手术切除的关键[6]。然而，异时性远处转移潜伏期较长，缺乏临床症状，难以发现。因此，研究预测异时性转移的有效手段成为改善结肠直肠癌预后的重点。

多项研究已证实，RAS-RAF-MAPK信号通路在结肠直肠癌的发生、发展过程中起重要作用[7-9]。同时，KRAS基因也是抗EGFR治疗能否起效的重要预测标志[10-12]。既往KRAS突变与异时性远处转移的报道较少。本研究比较原发灶根治术后无转移病人与发生异时性远处转移病人的临床病理特征及KRAS基因型的差异，寻找预测异时性远处转移的标志物，并建立多因素模型，提高预测准确性。

材料与方法

一、研究人群

回顾性选取2002年1月至2008年12月复旦大学附属中山医院普外科手术切除的结肠直肠癌病人。包括如下条件：18～75岁；初诊影像学检查明确无同时性远处转移；原发灶根治性切除；术后病理检查确诊结肠直肠癌；术前未接受化疗、放疗或介入治疗；病程中未接受靶向治疗。依据病人原发灶切除术后是否出现异时性远处转移，分为无转移组和转移组。远处转移定义为肝、肺、骨、脑等远处脏器的转移，包括锁骨下淋巴结转移，但不包括盆腔淋巴结、腹膜后淋巴结转移及腹膜播散。同时性远处转移定义为初诊即发现转移及原发灶根治术后6个月内出现转移。异时性远处转移定义为原发灶根治术6个月后出现远处转移。所有病人原发灶根治性切除术后均依据《卫生部结直肠癌诊疗规范（2017年版）》接受辅助治疗。仅出现远处转移后，可应用经导管动脉化疗栓塞和经导管动脉灌注化疗。

二、KRAS基因检测

选取原发灶根治性切除术后标本，经甲醛固定和石蜡包埋，连续切片。采用基因科技（上海）有限公司“GTpure FFPE DNA kit”抽提，制备DNA模板。采用PCR扩增KRAS第2外显子12密码子和13密码子片段。应用焦磷酸法测序（PyroMark ID system,PSQ 96 MA,Biotage AB,Sweden），检测相应突变。

三、随访

病人依据《卫生部结直肠癌诊疗规范（2017年版）》进行随访。术后2年内，每3～6个月1次病史询问、体格检查、肿瘤标志物检查、肝脏超声检查。术后2～5年，上述检查每6个月1次。术后5年内，每年1次胸、腹和盆腔增强CT扫描。复查结肠镜为术后1年内、第3年，以后每5年1次。怀疑肝转移的病人加行MRI检查，必要时行PET-CT检查。若发现远处转移，则追溯前一次检查结果，以明确转移灶出现的确切时间。

四、统计学方法

对于分类变量，采用χ2检验。如理论频数＜5或样本量＜40，则采用Fisher精确检验。采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，采用Log-Rank比较差异。单因素/多因素分析采用Logistic回归计算比数比(odds ratio，OR)和相应的95%CI。中位随访时间依据Schemper等[13]的报道进行计算。预测模型采用Logistic回归Backward Stepwise法建立，采用R软件绘制列线图 (Nomogram)，应用受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线进行内部效能检验，曲线下面积（area under the curve,AUC）＞0.7认为模型预测效能较好。其他统计学分析应用 SPSS 16.0软件。P值为双侧检验。P＜0.05为差异有统计学意义。将P＜0.1的因素纳入多因素分析。

结 果

一、KRAS基因突变情况

本研究随机纳入病人186例，按转移组与无转移组1∶1分组，其中无转移组93例，转移组93例。病人中位随访时间86个月，其中无转移组88个月，转移组84个月。无转移组KRAS基因野生型68例（73.1%）；突变型25例（26.9%）。转移组 KRAS 基因野生型49例（52.7%）；突变型44例（47.3%）。检测到病人7种KRAS基因突变类型，均为单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）。其中，KRAS第2外显子12密码子突变类型（6种）为c.35G ＞A,p.G12D；c.35G ＞T,p.G12V；c.34G ＞T,p.G12C；c.35G＞C,p.G12A；c.34G＞A,p.G12S；c.34G＞C,p.G12R。KRAS第2外显子13密码子突变类型（1 种）为 c.38G＞A,p.G13D。全体突变互斥，未检测到多重突变（见表1）。

表1 KRAS基因突变情况[n（%）]

二、KRAS基因突变与临床病理因素的相关性

对KRAS基因突变类型与临床病理因素进行相关性分析。结果显示，KRAS基因突变与原发灶根治术前 CEA(P=0.015)和异时性远处转移(P＜0.001)显著相关，与术后pN分期潜在相关(P=0.073)（见表2）。

表2 KRAS突变类型与临床病理因素的相关性[n（%）]

三、KRAS基因突变是发生异时性远处转移的独立影响因素

进一步对不同的临床病理因素及KRAS基因突变类型与结肠直肠癌的异时性远处转移的相关性进行了单因素及多因素分析。其中单因素分析结果显示，原发灶病理类型为黏液腺癌与异时性远处转移的发生时间呈潜在负相关 (OR=0.490，95%CI：0.220～1.090，P=0.080)，术后病理 N2 分期与异时性远处转移的发生时间呈潜在正相关 (OR=2.134，95%CI：0.993～4.585，P=0.052)。KRAS 基因c.35G＞T,p.G12V 突变型(OR=4.163，95%CI：1.267～13.681，P=0.019) 和 c.38G＞A，p.G13D 突变型 (OR=7.286，95%CI：2.352～22.567，P=0.001)与异时性远处转移呈正相关。多因素分析显示，女性(OR=0.426,95%CI：0.207～0.876,P=0.020)、 原发灶位于直肠(OR=0.408，95%CI：0.173～0.961，P=0.040)、原发灶组织学类型黏液腺癌 (OR=0.230,95%CI：0.075～0.709，P=0.010) 是异时性远处转移的独立保护因素。术后 pN2 分期(OR=4.191，95%CI：1.643～10.691，P=0.003)、KRAS 基因 c.35G＞T，p.G12V 突变型(OR=10.568，95%CI：2.568～43.499，P=0.001)和 c.38G＞A，p.G13D 突变型 (OR=12.657，95%CI：3.607～44.411，P＜0.001)是异时性远处转移的独立危险因素（见表3）。

表3 异时性远处转移单因素/多因素分析

对转移组病人转移发生时间的分析显示，异时性远处转移发生的中位时间为16个月，四分位数间距 (interquartile range,IQR)=10～28个月。其中，KRAS野生型病人转移中位时间为18个月，IQR=12～31 个月；c.35G＞A，p.G12D 突变型中位时间为11 个月，IQR=9～28 个月；c.35G＞T，p.G12V 突变型中位时间为 15 个月，IQR=8～34 个月；c.38G＞A，p.G13D突变型中位时间为13个月，IQR=9～19个月。KRAS基因 c.38G＞A，p.G13D 突变型相比野生型，远处转移发生中位时间潜在较短(P=0.066)，其余基因型之间的差异无统计学意义（见图1）。本研究KRAS基因p.G13D突变病人发生转移时间较野生型病人潜在较短（13 个月比 18 个月,P=0.066）。p.G12D 突变病人与野生型病人相比，发生转移的中位时间虽更短（11个月比18个月），但由于样本量有限，差异未能得出统计学意义（P=0.264），有待扩大样本量，开展进一步研究。

图1 不同KRAS基因型病人异时性远处转移发生中位时间

四、多因素模型预测异时性远处转移

以多因素分析结果为基础建立预测模型，最终纳入5个因素：性别、原发灶部位、原发灶组织学类型、术后pN分期和KRAS基因突变类型。建模因素均为异时性远处转移的独立影响因素。绘制相应列线图模型（见图2）。

图2 异时性远处转移多因素预测模型

ROC曲线检验TNM分期预测异时性远处转移，AUC=0.569，95%CI：0.487～0.652（见图3）。KRAS基因类型单独预测异时性远处转移，AUC=0.628,95%CI：0.548～0.709。多因素预测模型内部效能检验，AUC=0.767,95%CI：0.700～0.834。结果显示，该多因素模型内部预测性能良好，显著优于TNM分期(P＜0.001)和 KRAS 基因类型(P＜0.001)单个因素预测（见图3）。

图3 预测模型内部效能检验

讨 论

本研究显示，KRAS基因突变以 c.35G＞A,p.G12D；c.35G＞T,p.G12V 和 c.38G＞A,p.G13D 三种类型为主。其中，c.35G＞A,p.G12D 与异时性远处转移无明显相关性；c.35G＞T,p.G12V 和 c.38G＞A,p.G13D均是异时性远处转移的独立危险因素。以性别、原发灶的部位和组织学类型、术后pN分期和KRAS基因突变类型共5个因素建立多因素预测模型，可有效预测原发灶根治术后异时性远处转移的发生。

KRAS基因突变主要表现为SNP[14-15]。除外无氨基酸表达改变的无意义突变，KRAS基因SNP通过关键位点氨基酸的改变影响KRAS表达蛋白质的结构，从而影响其生物学功能。本研究显示，KRAS第2 外显子 12 密码子发生 c.35G＞A,p.G12D 突变后，尽管氨基酸发生改变，但在肿瘤远处转移方面影响并不显著；然而c.35G＞T,p.G12V突变显著提高异时性远处转移的发生率。因此，即使是同一位点的突变，突变类型不同，也会导致生物学性状不同。提示在个体化治疗中，不应以突变基因位点简单区分病人，而应关注突变基因的具体生物学性状。

本研究也存在缺陷。首先，纳入样本量较少，未包含KRAS的全部突变类型，且部分突变种类频率较低，未进行有效的统计学分析。其次，建立的多因素预测模型仅接受内部验证，尚需外部验证以明确其预测效能。第三，众所周知，结肠直肠癌是一种多基因相关的恶性肿瘤，仅检测单个KRAS基因无法精确预测疾病进程。这是今后研究的又一个方向。

本研究证实，KRAS 基因 c.35G＞T,p.G12V 和c.38G＞A,p.G13D 突变是异时性远处转移的独立危险因素。本研究建立的多因素预测模型较好地预测结肠直肠癌原发灶根治术后异时性远处转移的发生。模型还需多中心、大样本验证，进一步明确其有效性与适用范围。