水产品中孔雀石绿、硝基呋喃、氯霉素残留免疫胶体金前处理过程的探讨

叶江雷，林功师，林 楠，林 涛

(1.厦门海洋职业技术学院，福建 厦门 361100；2.厦门市海洋与渔业研究所，福建 厦门 361008；3.福建省水产技术推广总站，福建 福州 350002)

根据《食品动物中禁止使用的药品及其他化合物清单》(中华人民共和国农业农村部公告第250号)明令禁止孔雀石绿、硝基呋喃类、氯霉素等三类六项药物在水产养殖中使用。免疫胶体金技术是以胶体金为示踪标记物应用于抗原抗体反应的一种免疫标记技术，作为快检试剂盒主要是以免疫层析(Immuno-chromatography，ICA)技术为基础，其优点是方法简单快速、无需仪器设备和特殊训练等，不足是仅适用于单份测定，难以进行质量控制，一般仅适用于定性试验[1-2]。在应用该法进行日常检验时，因基质干扰，出现“假阴性”机率较大。

本文拟在梳理免疫胶体金法检测各类水产品中孔雀石绿等三类药残各自前处理的基础上，为基层检测人员在遇到特殊样品时，就如何降低“假阴性”率和提高可靠性、如何改进前处理过程提供建议。

1 孔雀石绿

1.1 理化性质

孔雀石绿(Malachite green，MG，图1)，化学名为四甲基代二氨基三苯甲烷，分子式为C23H25-ClN2，又名碱性绿、孔雀绿或者中国绿，是一种有毒的三苯甲烷类人工合成有机化合物，属三苯甲烷类染料，同时它既是染料，也是杀菌剂，可致癌。孔雀石绿为无臭、无味的带有金属光泽的绿色结晶体，易溶于水，也溶于乙醇、乙腈、甲醇和戊醇等极性溶剂中，水溶液呈蓝绿色。孔雀石绿进入水产动物体内后，通过一系列的转化和新陈代谢，绝大部分转化为脂溶性的隐色孔雀石绿(Leuco malachite green，LMG，图2)，并在生物体内不同组织中蓄积，因此在水产动物组织中主要的残留物是隐色孔雀石绿[2]。

1.2 典型的前处理过程

1)样品制备：水产品取肌肉部分约50 g，剪碎，均质机均质。

2)提取：称取(5.0±0.1)g均质样于50 mL离心管中，加入3 mL提取剂(内含pH 4.5的缓冲溶液和少量还原剂)、极性有机溶剂(10 mL乙腈)，剧烈振荡3 min。

3)净化去脂：加入固体提取剂(4 g中性氧化铝粉末)去除极性的杂质，剧烈振荡3 min后，再加入脱水剂(如2 g氯化钙)，剧烈振荡1 min；室温下4 000 r/min离心5 min。用移液滴管移取5 mL上清液于5 mL离心管中，加入非极性有机溶剂(4 mL正己烷)，混匀；室温下4 000 r/min离心1 min。

4)氧化、吹干与复溶[3-5]：用刻度滴管取4 mL下层液体于5 mL离心管中，加入氧化剂(0.1 mL 0.1%四氯苯醌)将隐色孔雀石绿全部氧化为孔雀石绿，混合均匀1 min后，65℃下空气吹干；向吹干的试管中加入复溶液(0.3 mL PBST缓冲液)，冲洗溶解试管内壁上残留物；静置2 min，吸取至少0.1 mL溶液，待检。

1.3 试剂

1)缓冲溶液：pH 4.5的缓冲溶液成分通常为乙酸胺+少量的对甲苯磺酸(图3)[3，6](其中对甲苯磺酸溶液作为离子对试剂，有利于孔雀石绿形成离子对，增加乙腈对该物质的提取效率[6])，或直接以乙酸铵[7]为提取溶液。

2)提取剂：通常使用极性溶剂，如乙腈[3]或乙酸乙酯[8]。

3)还原剂：盐酸羟胺[3，9]或硼氢化钾[10]。

4)脱水剂：常用的脱水剂为无水硫酸钠(Na2SO4)[7，11]和/或氯化钙(CaCl2)[3]。但因乙腈与提取液中的水互溶，考虑后续吹干步骤及提高提取率需要除水，为减少吹干溶剂体积，选用除水效果好的CaCl2[6]。

5)净化剂：去除脂肪主要使用正己烷[3，8]；去极性杂质主要使用中性氧化铝[3，6]。

6)氧化剂：孔雀石绿胶体金检测板通常只对孔雀石绿产生特异性免疫反应，因此，需将水产动物组织中的隐色孔雀石绿氧化为显性，常用的氧化剂为四氯苯醌(图4)[3，6，9]、2，3-二氯-5，6-二氰对苯醌(DDQ，图5)[8]、重铬酸钾水溶液[7]和过氧化氢[11]。

1.4 建议

关键点与建议：1)脱水剂使用效率较高的CaCl2；2)脂肪影响脂溶性的隐色孔雀石绿的提取效率，并干扰检测板而易出现“假阴性”[6]，净化时可以增加正已烷的用量或/和使用非极性填料提高脂肪的去除效率。

2 硝基呋喃类

2.1 理化性质

硝基呋喃类(Nitro-furans，NFs)，骨架结构为5-硝基呋喃环(图6)，因取代基R不同，构成了不同的该类药物(图7)。许多年来，这类广谱抗菌药作为食品添加剂、促生长剂用于治疗细菌感染而被广泛应用于农牧饲养和水产养殖中。常用的硝基呋喃类药物有呋喃唑酮(Furazolidone，FZD)、呋喃它酮(Furaltadone，FTD)、呋喃西林(Nitrofurazone，NZF)和呋喃妥因(Nitrofurantoin，NFT)，共四种；其标志性代谢物分别为1-氨基-2-内酰脲(AHD)、3-氨基-2-唑烷基酮(AOZ)、氨基脲(SEM)和5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮(AMOZ)[12]。

硝基呋喃类抗生素难溶于水、易溶于有机溶剂，对人体具有潜在的致畸、致癌和致突变的危害作用。虽然动物被给药后，对其代谢速度快，在可食组织中几乎不能检测到原药残留，但其代谢物能与组织蛋白结合后形成稳定的蛋白结合物并且长期稳定存在。检测生物体内硝基呋喃类药物主要是建立在检测它的代谢物的基础上。

2.2 典型的前处理过程

水产样品取肉，均质成糜状；在一定温度下，与动物体内组织蛋白结合的硝基呋喃代谢物在酸性条件下酸解而被释放，并与衍生化试剂反应形成硝基呋喃代谢物衍生化物，提高检测灵敏度，调节pH后以极性溶剂提取，净化提取液分2种方法。

1)吹干除水分，以非极性溶剂除脂肪[13]、极性溶液复溶待测。

2)过非极性SPE柱除脂肪[14](有时为了去除极性的杂质，在酸解、衍生化阶段添加酸性氧化铝、硅胶C18键合材料或吸附型离子交换脂，或在非极性SPE串接装填这些填料的小柱[15])；洗脱、待测。

2.3 试剂

1)酸解或水解：通常使用的溶液有盐酸[13，16-17]或添加盐酸的甲醇混合溶液[18]，也可以甲醇-水混合溶液[19]。

2)衍生化试剂：主要有2-硝基苯甲醛(2-NBA)[1，13，20]、4-硝基苯甲醛(4-NBA)[1，20]、4-羰基苯甲醛(4-CBA)[1，20]、邻氯苯甲醛[15]、2-羟基-1-萘甲醛[18](图8)。

3)衍生化条件：不同温度下衍生所需时间也有所变化：65℃、30 min[16，21]；60℃、1 h(注意避光)[13]；56℃环境中孵育2 h[22]；50℃、2 h[23]；40℃摇床振摇或超声60 min[15]；37℃ 避光水解衍生约16 h[24]；(37±2)℃烘箱内，避光放置过夜[14]；37℃恒温水浴条件下孵育2 h[17]。

4)调节pH：以磷酸氢二钾溶液为基础，用NaOH溶液[13，21]调节pH值为7.4[25]左右。

5)极性溶剂提取：乙酸乙酯[13，18，21-22，25]。

6)吹干：可在不同温度下吹干，如50℃(N2)[22]、60℃(N2)[16]、 65℃(N2或空气)[17]。

7)去脂肪：主要以非极性溶剂正己烷[13，16-17，21-22，25]溶解脂肪后，与极性提取分离。固相萃取法以非极性填料(如Oasis HLB)吸附脂肪后，以极性溶剂乙酸乙酯洗脱[19]；或以混合C18-CN填料净化，再以极性溶剂甲醇洗脱[15]。

8)复溶：以PBST 缓冲液[16-17]为主，有时也使用氯化钠溶液[21]、乙腈+异辛烷溶解[15]、乙酸-乙腈(7+3)[14]进行复溶。

2.4 建议

关键点与建议：1)在不限时间和温度不变的条件下，尽可能延长衍生化(图9)的时间；2)参见1.4的第2点；3)适当降低NaOH浓度以提高pH调节精度。

3 氯霉素

3.1 理化性质

氯霉素(图10)是一种采用化学合成法生产的抑菌性广谱抗生素，其化学名称为D-(-)-苏阿型-1-对硝基苯基-2-二氯乙酞胺基-1，3-丙二醇(简称氯胺丙醇)，最初用于临床，后来被广泛用于防治病害、水体消毒等水产养殖和畜禽养殖业中。

氯霉素易溶于极性溶剂，难溶于非极性溶剂；性质很稳定(即使在沸水中煮沸5 h不失效)，食品中一旦有氯霉素残留，就没有合适的方式可将其消除[26]。

3.2 典型的前处理过程

极性溶剂(乙酸乙酯)提取，离心、取上层有机相后，分别以1)非极性溶剂(正己烷)；2)非极性SPE柱(ProElut PLS氯霉素专用小柱[27]、C18SPE柱[28])吸附的方式去除脂肪；3)以蛋白质沉淀剂(硫酸锌和亚铁氰化钾)去除蛋白质[29]等的干扰，以提高检测结果的可靠性[30]。除去提取液中的水分，通常使用无水硫酸钠柱和/或真空旋转蒸干[27]、吹干[31]。

如果基质干扰较少时，可以直接以极性有机溶液(如甲醇)提取，再以PBST稀释、待测[27，29]。

3.3 建议

关键点与建议：1)极性有机溶剂提取；2)去除脂肪(参见1.4的第2点)和/或蛋白质；3)去除水分(参见1.4的第1点)，以减少对仪器设备的依赖。

4 总结

为了提高孔雀石绿等三类药物残留的前处理效率、快速检测的实用性和可靠性，多家试剂盒供应商将水产品中禁用的三类药残的检测整合在同一个前处理流程，并对相关的现场操作规范经过多轮次改进[32]。其中三类水产品中药残前处理的共性为极性溶剂提取、去除脂肪和去除水分等关键步骤，为整合三个流程提供了可能；但由于1)孔雀石绿，将脂溶性的隐色孔雀石绿转(氧)化为易溶于极性溶剂的孔雀石绿，2)硝基呋喃类，因需将与组织蛋白稳定结合的代谢物酸解出再衍生化等差异，而必须保留如水浴衍生化等无法替代的步骤。为了配合现场、快速检测的特点，通常1)减化离心机、空气吹干仪等辅助设备的使用，减少了离心、吹干等操作步骤；2)同时，为了提高去脂肪的效率，以简化的SPE过程替代正己烷去脂肪的流程[33]。

商品化的快检试剂盒通常具有一定的针对性，基层检测单位通常选择能够覆盖本单位样品范围的某一型号试剂盒即可满足日常检测；但出现异常样品时，必须通过试剂盒供应商进行改进。

本文在分析和归纳近年来水产品中这三类药残各自的前处理过程基础上，介绍各种干扰因素、对应所使用的试剂，为基层检测人员在已采用的快检方法基础上自行优化前处理过程、甚至设计前处理过程提供线索。水产品的种类多，样品的基质差异大，即使有针对某一型号的试剂盒在某些方面做了改进，也无法完全覆盖所有样品。因此，建议基层单位在遇到某一种或类的特殊样品时，在已采用的方法基础上，对前处理方法进行适当优化，并做好优化后方法的验证工作和过程记录，备查和扩项。