模糊数学感官评价结合响应面法优化黑枸杞-刺梨风味发酵乳发酵工艺

贾庆超，梁艳美

（1.郑州科技学院食品科学与工程学院，河南 郑州 450064；2.安阳工学院计算机科学与信息工程学院，河南 安阳 450064）

发酵乳是以生牛乳或乳粉为原料，经杀菌、发酵后制成的pH值降低的产品[1]。发酵乳发酵后，牛奶中的钙被转化为水溶性钙，很容易被机体所吸收利用[2]。发酵乳制品可以增强人体免疫力、调节机体生理、预防疾病。目前市场上发酵乳的种类很多，如莫斯利安、安慕希等，但风味型发酵乳却非常少，所以研制风味型发酵乳具有重要的意义。

黑枸杞（Lycium ruthenicumMurr.）具有保护皮肤屏障、降低血压、增强人体免疫力、降低胆固醇、抑制肿瘤、抗氧化等药理功效[3-7]。刺梨（Rosa roxbunghii）多生长在云南、贵州地区，含有丰富的维生素C、总黄酮、多糖和超氧化物歧化酶等活性物质，具有促进胃肠道消化，提高人体免疫力、抗氧化、延缓衰老等功效[8-12]。

本研究以刺梨干果、黑枸杞、纯牛奶为原料发酵制备一款风味发酵乳，以感官评分、蛋白质含量为响应值，采用模糊数学感官评价结合响应面优化法对其发酵工艺进行优化，并对发酵乳的感官、理化及微生物指标进行检测，这不仅开发了刺梨的市场前景，同时也为黑枸杞刺梨发酵型乳饮料的发展提供数据参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料与菌株

黑枸杞：宁夏宁安堡土特产品有限公司；刺梨：深圳贰拾贰号工坊食品有限公司；纯牛奶（蛋白质3.4 g/100 mL）：江苏光明银宝乳业有限公司；菌种ABY-10（200 U/袋）：丹尼斯克（中国）有限公司。

1.1.2 培养基MRS、MC培养基：青岛海博生物技术有限公司；孟加拉红、平板计数琼脂：北京陆桥技术股份有限公司。

1.1.3 试剂

蔗糖（食品级）：云南滇鹏糖业有限公司；增稠剂（食品级）：丹尼斯克（中国）有限公司；氢氧化钠、乙酸铅、磷酸氢二钠、浓硫酸、硫酸铜、氨水、盐酸萘乙二胺、亚硝酸钠、硫酸钾、乙醚、石油醚、甲醇、乙腈、辛烷磺酸钠（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；三聚氰胺标准品（纯度＞99%）：武汉中昌国研标物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

SPECORD 210紫外可见分光光度计：德国耶拿分析仪器股份有限公司；Kjeltec8400全自动凯式定氮仪：丹麦福斯分析仪器有限公司；1260高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪、7890B气相色谱（gas chromatography，GC）仪：美国安捷伦有限公司；PHB-4型pH计：上海精科仪器有限公司；XG1.CD-300M卧式灭菌锅：山东新华医疗器械有限公司；XPE205DR分析天平：瑞士梅特勒托利多公司；N1-50全自动氮吹浓缩仪：广州仪德精密科学仪器股份有限公司；SPX-250B-Z生化培养箱：上海博讯医疗生物器械有限公司；FT1乳品快速分析仪：丹麦福斯公司；DH3600B Ⅱ电热恒温培养箱：天津市泰斯特仪器有限公司；BX53F显微镜：德国蔡司股份有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 黑枸杞-刺梨风味发酵乳的制备工艺

操作要点：

黑枸杞汁的制备：选取果实饱满、外表无损坏、无发霉变质的优质黑枸杞，去除杂质，放入纯水中清洗干净，晾干，按照料液比1∶15[13]的比例混合后放入破碎打浆机中打浆，升温至70 ℃浸提4 h，用80目过滤塞过滤，即得黑枸杞汁。

刺梨汁的制备：挑选个大且有光泽、无损坏的刺梨干果，去蒂，用纯水清洗干净，晾干，将刺梨与水按照1∶10的比例混合，放入破碎打浆机中打碎，加热至微沸浸提35 min，用80目过滤塞过滤，即得刺梨汁。

混合：以发酵乳的总质量为基准，在牛奶中添加5%刺梨汁、12%黑枸杞汁、5%蔗糖、0.06%增稠剂，混匀。

均质：常温下采用均质机1 200 r/min均质15 min。

灭菌、冷却：将混合液在70 ℃水浴锅中灭菌15 min，并冷却至40 ℃。

接种：在灭菌、冷却后的40℃混合液中加入菌种ABY-10 0.002%，搅拌均匀，覆盖保鲜膜隔氧。

发酵：将混合液置于43 ℃恒温条件下发酵5 h，待混合液由液态变为固态凝乳，滴定酸度达到70 T°即为发酵完成。

后熟：将发酵后的发酵乳放于4～6 ℃的冰箱中后熟12 h，即得成品。

1.3.2 黑枸杞-刺梨风味发酵乳发酵工艺优化单因素试验

按照黑枸杞-刺梨风味发酵乳发酵工艺，依次考察黑枸杞汁添加量（6%、8%、10%、12%、14%）、刺梨汁添加量（3%、5%、7%、9%、11%）、蔗糖添加量（4%、5%、6%、7%、8%）、发酵时间（4 h、5 h、6 h、7 h、8 h）、菌种ABY-10接种量（0.001%、0.002%、0.003%、0.004%、0.005%）对黑枸杞-刺梨风味发酵乳感官评分及蛋白含量的影响，确定枸杞汁添加量、刺梨汁添加量、蔗糖添加量、发酵时间、菌种ABY-10接种量。

1.3.3 黑枸杞-刺梨风味发酵乳的感官评价

所选择的10位感官评价人员为光明乳业实验中心经过感官评价培训的人员，把经过后熟后的黑枸杞-刺梨风味发酵乳倒入透明的玻璃试吃杯中，在采光良好的实验室内观察发酵乳的色泽，轻轻摇动品尝杯并观察发酵乳的组织状态，仔细闻气味，每次感官评价前应先用温开水漱口，评价前12 h不可以吃辛辣刺激性食物，评价人员无生理感官缺陷，评价期间不互相讨论，保证客观真实评价。具体评价标准见表1。

表1 黑枸杞-刺梨风味发酵乳的感官评价标准Table 1 Sensory evaluation standards of fermented black wolfberry-Rosa roxburghii flavor milk

1.3.4 模糊数学感官评价模型的建立（1）因素集和评语集的建立

以色泽（U1）、状态（U2）、滋味（U3）和气味（U4）4个评价指标组成黑枸杞-刺梨风味发酵乳的评价因素集，即U=（色泽U1，状态U2，滋味U3，气味U4）。以优V1、良V2、中V3、差V4组成对黑枸杞-刺梨风味发酵乳每个因素的评语集，即V=（优V1，良V2，中V3，差V4）。

（2）权重集的确定

方法采用用户调查法和二元对比法确定每个指标的权重[14-15]，邀请10位经过培训的感官评价人员对影响黑枸杞-刺梨风味发酵乳的因素项目重要性进行投票，通过影响因素的两两比较，认为重要的得1票，次要的得0票，自身对比得1票，1票即为1分，各项指标的得票数占各指标的总票数的比率即为各指标所占的权重，各因素的权重分布见表2。

表2 各因素的权重分布Table 2 Weight assignment of each factor

根据统计结果，权重集M=（M1，M2，M3，M4）=（0.35，0.25，0.14，0.26），其中M1、M2、M3、M4分别为风味发酵乳的评价指标滋味、气味、色泽、状态的权重。

（3）模糊矩阵的建立及评价结果的确定

邀请10名感官评价人员根据感官评价标准，对黑枸杞-刺梨风味发酵乳的各个因素进行感官评价，计算出各个影响因素在优、良、中、差四个等级中的票数分布，将各个因素得票数分别除以感官评价总人数10，即可得到yij（i=1，2，…n；j=1，2…m），所以根据得票结果，第k号试验样品的模糊矩阵建立如下：

k为第k号试验样品，根据模糊矩阵的变换的原理，感官评价的综合评价结果P的计算公式为：P=M×Uk，为了得到k号试验样品的准确的感官评分，将感官评价标准中的优、良、中、差分别赋值为90分、80分、70分、60分，将感官评价结果P值与相应的赋值相乘，再相加，即可得到最终的k号样品的感官评分Y。

1.3.5 黑枸杞-刺梨风味发酵乳发酵工艺优化响应面试验[16-18]

在单因素试验基础上，确定黑枸杞汁的添加量为12%，以感官评分（R1）、蛋白质的含量（R2）为响应值，选取影响较大的因素刺梨汁添加量（A）、菌种接种量（B）、发酵时间（C）和蔗糖添加量（D）为考察因素，采用Design-Expert10.0.7软件，根据Box-Behnken设计原理，进行4因素3水平的响应面优化试验，试验因素与水平见表3。

表3 Box-Behnken试验设计因素与水平Table 3 Factors and levels of Box-Behnken experiments design

1.3.6 黑枸杞-刺梨风味发酵乳品质的测定

（1）理化指标的测定

脂肪含量的测定：参照GB 5009.6—2016《食品中脂肪的测定》中的碱水解法；蛋白质含量的测定：参照GB 5009.5—2016《食品中蛋白质的测定》中的凯氏定氮法；乳糖、蔗糖含量的测定：参照GB 5413.5—2010《婴幼儿食品和乳品中乳糖、蔗糖的测定》中的莱因-埃农氏法；酸度的测定：参照GB 5009.239—2016《食品酸度的测定》中的酚酞指示剂法；水分含量的测定：参照GB5009.3—2016《食品中水分的测定》中的直接干燥法；脂肪非脂乳固体的测定：参照GB5413.39—2010《乳和乳制品中非脂乳固体的测定》；亚硝酸盐含量的测定：参照GB 5009.33—2016《食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》中的分光光度计法；三聚氰胺含量的测定：参照GB/T 22388—2008《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》中的HPLC法。

（2）微生物指标的测定

乳酸菌的测定：参照GB 4789.35—2016《食品微生物学检验乳酸菌检验》；霉菌及酵母计数：参照GB 4789.15—2016《食品微生物学检验霉菌和酵母计数》。

2 结果与分析

2.1 黑枸杞-刺梨风味发酵乳发酵工艺优化单因素试验

2.1.1 黑枸杞汁添加量对风味发酵乳的影响

由图1可知，随着黑枸杞汁添加量的增加，感官评分呈先升高后下降的趋势，蛋白质的含量呈下降的趋势，但变化不明显。当黑枸杞汁添加量＜12%，风味发酵乳色泽较差，呈暗灰色；随着黑枸杞汁的增加色泽逐渐改善，当黑枸杞汁的添加量为12%时，感官评分达到最高，为83.56分，蛋白质含量为2.81 g/100 g，发酵乳呈香芋色，有枸杞清淡的香味；当黑枸杞汁添加量＞12%，发酵乳颜色较深，色泽不佳。故选择12%为最适添加量。

图1 黑枸杞汁添加量对风味发酵乳感官评分及蛋白质含量的影响Fig. 1 Effect of black wolfberry juice addition on sensory score and protein content of flavor fermented milk

2.1.2 刺梨汁添加量对风味发酵乳的影响

由图2可知，随着刺梨汁添加量的增加，感官评分呈先升高后下降的趋势，蛋白质的含量呈下降的趋势。当刺梨汁添加量＜5%，风味发酵乳刺梨风味较淡；当刺梨添加量为5%时，发酵乳有刺梨的清香，感官评分最高，为84.34分，蛋白质含量为2.86 g/100 g；当刺梨汁添加量＞5%，发酵乳色泽为暗黄色，呈酸涩味，且随着刺梨汁的增加，涩味增加。故选择最适刺梨汁添加量为5%。

图2 刺梨汁添加量对风味发酵乳感官评分及蛋白质含量的影响Fig. 2 Effect of Rosa roxburghii juice addition on sensory score and protein content of flavor fermented milk

2.1.3 蔗糖添加量对风味发酵乳的影响

由图3可知，随着蔗糖添加量的增加，风味发酵乳的感官评分及蛋白质含量呈先升高后下降的趋势，但蛋白质含量变化不明显。当蔗糖添加量＜6%，发酵乳甜度不足，较酸；当蔗糖添加量为6%时，发酵乳酸甜合适，感官评分最高，为87.75分，蛋白质含量为2.84 g/100 g；当蔗糖添加量＞6%，发酵乳偏甜。故选择蔗糖添加量为5%、6%、7%作为响应面参数。

图3 蔗糖添加量对风味发酵乳感官评分及蛋白质含量的影响Fig. 3 Effect of sucrose addition on sensory score and protein content of flavor fermented milk

2.1.4 发酵时间对风味发酵乳的影响

由图4可知，随着发酵时间的延长，风味发酵乳的感官评分呈先升高后下降的趋势，蛋白质含量呈下降的趋势，但变化不明显。当发酵时间＜6 h，发酵乳凝固型不好，有乳清析出；当发酵时间为6 h时，发酵乳的感官评分最高，为87.55分，蛋白质含量为2.84 g/100 g，发酵后凝固型较好，酸甜感最佳，口感细腻柔和；当发酵时间＞6 h，发酵乳酸甜不合适。故选择最适发酵时间为6 h。

图4 发酵时间对风味发酵乳感官评分及蛋白质含量的影响Fig. 4 Effect of fermentation time on sensory score and protein content of flavor fermented milk

2.1.5 菌种ABY-10接种量对风味发酵乳的影响

由图5可知，随着菌种ABY-10接种量的增加，风味发酵乳的感官评分呈先升高后下降的趋势，蛋白质含量呈下降的趋势。当菌种接种量＜0.003%，发酵乳凝固性不好，状态不佳；当菌种接种量为0.003%时，发酵乳的状态较好，酸甜合适，此时感官评分最高为89.05分，蛋白质含量为2.84 g/100 g；当菌种接种量＞0.003%之后，发酵乳逐渐变酸，酸甜比例不合适。故选择最适菌种接种量为0.003%。

图5 菌种ABY-10接种量对风味发酵乳感官评分及蛋白质含量的影响Fig. 5 Effect of strain ABY-10 inoculum on sensory score and protein content of flavor fermented milk

2.2 黑枸杞-刺梨风味发酵乳发酵工艺优化响应面试验

依据单因素试验结果，确定黑枸杞汁的添加量为12%，以感官评分（R1）和蛋白质含量（R2）为响应值，选择对黑枸杞-刺梨风味发酵乳影响显著的4个因素刺梨汁添加量（A）、菌种接种量（B）、发酵时间（C）和蔗糖添加量（D）进行4因素3水平的响应面优化试验，各因素评价的投票数见表4，响应面试验设计及结果见表5，以感官评分为响应值回归模型的方差分析结果见表6。

表4 黑枸杞-刺梨风味发酵乳感官评价票数分布Table 4 Distribution of sensory evaluation votes of fermented black wolfberry-Rosa roxburghii flavor milk

表5 响应面试验设计与结果Table 5 Design and results of response surface experiments

表6 以感官评分为响应值回归模型的方差分析结果Table 6 Variance analysis results of regression model using sensory score as response value

续表

采用表4中的数据建立模糊评价矩阵，将每个样品的各自影响因素的得票数除以总参与评价人数（10）即可得到各个模糊矩阵U1～U29，以1号产品为例：色泽的评价人数分别为：8人选优，2人选良，0人选中，0人选差，则U色泽=（0.8，0.2，0，0），同理，U状态=（0.7，0.2，0.1，0），U滋味=（0.2，0.2，0.3，0.3），U气味=（0.8，0.2，0，0），由此可得到矩阵U1：

根据模糊数学计算原理和权重集M=（M1，M2，M3，M4）=（0.35，0.25，0.14，0.26），按照矩阵相乘方法，感官评价结果F1=M×U1=（0.564，0.200，0.131，0.105），对于F中的各个量，分别赋予其相应分值，优、良、中、差分别为90分、80分、70分、60分，F中各个值分别乘以相应分值，再相加即可得到1号样品感官评分，即1号样品感官评分：T1=0.564×90+0.2×80+0.131×70+0.105×60=82.23，同理可以计算出2～29号样品的感官得分。

对表5中的数据进行回归拟合分析，得到的回归方程为R1=87.40-4.28A-1.39B+1.28C+1.47D+1.05AB+0.99AC+0.062AD+1.15BC+2.76BD-0.21CD-5.40A2-2.57B2-3.51C2-5.24D2；R2=2.76-0.10A-4.167E-0.03B+0.021C-0.018D-7.500E-003AB-0.018D-7.500E-003AB-0.015AC+7.500E-0.03AD-5.000E-003BC+2.500E-003CD+2.500E-003CD+0.028A2+4.167E-003B2+0.019C2+7.917E-003D2。

复相关系数R2∈[0，1]，它的值越接近1误差影响就越小，回归方程越准确[19-20]。R2可以描述响应曲面的拟合程度，但它的值会随着回归方程中自变量个数的改变而发生改变[21-26]。由表6可知，模型的P＜0.000 1，说明试验所采用的二次回归模型是极显著的。失拟项P=0.079 9＞0.05，说明对模型是有益的，模型具有高度可靠性[23-25]。对试验模型的可信度进行分析，得到决定系数R2=0.929 1，表明响应值的变化92.91%来自于所选因素，方程的拟合度较好，方程的调整决定系数R2Adj=0.858 1，说明有85.81%的试验符合该模型，与实际情况符合良好[25-28]。变异系数（coefficient of variation，CV）=2.37%，较小，表明方程模型具有良好重现性[29]。由表6亦可知，一次项A，二次项A2、B2、C2、D2对结果影响极显著（P＜0.01），一次项B、C、D，交互项BD对结果影响显著（P＜0.05）。根据F值，各因素对试验结果影响的先后次序为A＞D＞B＞C。交互项BD对结果影响的响应面及等高线见图6。

图6 菌种ABY-10接种量及蔗糖添加量交互作用对黑枸杞-刺梨风味发酵乳感官评分影响的响应面及等高线Fig. 6 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between strain ABY-10 inoculum and sucrose addition on the sensory score of fermented black wolfberry-Rosa roxburghii flavor milk

响应面越陡峭，等高线越密集，表明该因素对试验结果影响越显著[29]。由图6可知，BD响应面较陡峭，等高线越接近于椭圆形，说明BD交互项对结果影响显著，与方差分析结果一致。以蛋白质含量为响应值回归模型的方差分析结果见表7。

由表7可知，模型的P＜0.000 1，说明试验所采用的二次模型是极显著的；失拟项P=0.199 7＞0.05，说明对模型是有益的，模型具有高度可靠性[23-24]。对试验模型的可信度进行分析，得到决定系数R2=0.961 1，表明响应值的变化96.11%来自于所选因素，方程的拟合度较好，方程的调整决定系数R2Adj=0.922 2，说明有92.22%的试验符合该模型，与实际情况符合良好[25-28]。CV=0.73%，较小，说明方程模型具有良好重现性[29]。一次项A、C、D，二次项A2对结果影响极显著（P＜0.01），二次项C2对结果影响显著（P＜0.05）。根据F值，各因素对试验结果影响的先后次序为A＞C＞D＞B。

表7 以蛋白质含量为响应值回归模型的方差分析结果Table 7 Variance analysis results of regression model using protein content as response value

利用Design-Expert 10.0.7对感官评分和蛋白质含量回归方程进行回归分析，黑枸杞-刺梨风味发酵乳的最佳发酵工艺为：刺梨汁添加量4.28%，菌种ABY-10接种量0.003 4%，发酵时间6.071 h，蔗糖添加量6.05%。在此优化条件下，风味发酵乳感官评分的理论值为88.596分，蛋白质含量为2.80 g/100 g。考虑到实际工艺条件，调整最佳发酵工艺条件为刺梨汁添加量4.3%，菌种ABY-10接种量0.003%，发酵时间6 h，蔗糖添加量6%。在此优化条件下进行3次平行验证试验，感官评分及蛋白质含量分别为（88.58±0.08）分、（2.79±0.01）g/100 g，与预测值接近，说明该模型可以用于优化黑枸杞-刺梨风味发酵乳发酵工艺。

2.3 黑枸杞-刺梨风味发酵乳理化及微生物指标

黑枸杞-刺梨风味发酵乳的感官品质、理化指标及微生物指标分别见表8～表10。由表8～表10可知，黑枸杞-刺梨风味发酵乳的感官品质、理化和微生物指标均符合相关国标要求。

表8 黑枸杞-刺梨风味发酵乳的感官品质Table 8 Sensory quality of fermented black wolfberry-Rosa roxburghii flavor milk

表9 黑枸杞-刺梨风味发酵乳的理化指标Table 9 Physicochemical indexes of fermented black wolfberry-Rosa roxburghii flavor milk

表10 黑枸杞-刺梨风味发酵乳的微生物指标Table 10 Microbial indexes of fermented black wolfberry-Rosa roxburghii flavor milk

3 结论

以刺梨干果、黑枸杞、纯牛奶为原料，以感官评分、蛋白质含量为评价指标，利用模糊数学评价结合响应面法优化得到黑枸杞-刺梨风味发酵乳的最优发酵工艺为：黑枸杞汁添加量12.0%，刺梨汁添加量4.3%，蔗糖添加量6.0%，菌种ABY-10接种量0.003%，发酵时间6 h。在此优化条件下，黑枸杞-刺梨风味发酵乳的感官评分为88.60分，蛋白质含量为2.80 g/100 g，其感官指标、理化指标及微生物指标均符合相关国标要求。