醋蛋液对巨噬细胞RAW264.7免疫调节活性的影响

柳昊睿，邱 瑜，牟芳茗，耿晓琦，宋 佳*

（天津科技大学生物工程学院工业发酵微生物教育部重点实验室天津市微生物代谢与发酵过程控制技术工程中心，天津 300457）

醋蛋液作为我国一种传统食品，是一种药食兼用的饮品。醋蛋液是我国民间流传很久的一种食疗食品，我国也是世界上最早使用醋蛋液进行保健的国家[1]。我们的祖先早已有用食醋浸泡鸡蛋来治疗某些疾病的先例。许多民间偏方也常用醋蛋液预防治疗腮腺炎、灰指（趾）甲、毒虫叮咬、腰腿痛等症，所以自古就有“醋蛋治百病”之说[2-5]。近年来，有关醋蛋医疗保健以及药理作用的研究报道越来越多。中医理论认为，食醋性温味酸苦，有开胃、养肝、散瘀、止痛等功效[6]。鸡蛋味甘性平，有补中益气、养阴定惊等作用[7]。两者结合形成的醋蛋液具有抗氧化、降脂降压、抑菌等主要功能，对失眠和食欲不振等多种常见疾病有良好的效果，深受医学专家推崇[8]。

巨噬细胞来源于单核细胞，作为一种多功能效应细胞，在免疫系统中具有防御及调节功能[9-10]。巨噬细胞最重要的功能是吞噬功能，它可以通过直接吞噬外来抗原、损伤衰老细胞以及病原微生物进而起到免疫清除的作用，从而实现机体内环境稳定。除此之外可以通过呈递抗原和分泌不同的活性物质参与机体的免疫应答过程，主要表现在对先天免疫应答中的重要作用[11]。CHEONG K T等[12]通过免疫调节实验表明，从冬虫夏草中分离得到的多糖可以显著改善巨噬细胞的细胞增殖和吞噬能力，并且通过激活丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）和核因子-κB（nuclear factor，NF-κB）信号通路释放一氧化氮（nitrogen oxide，NO）和细胞因子从而提高机体的免疫能力。此外还有研究表明，甘草多糖还可以通过增加巨噬细胞体积，使其伪足增多，提高其表面积起到调节细胞的免疫作用[13]。

醋蛋液可以激活免疫细胞，促进细胞因子的分泌，提高机体免疫力进而增强机体的抗感染及抗肿瘤能力。醋蛋液作用于U937细胞，可以促使其分泌大量细胞因子如白细胞介素（interleukin，IL-1β）、干扰素（interferon，IFN-γ）、肿瘤坏死因子（tumour necrosis factor，TNF-α）及NO，起到免疫调节作用进而诱导U937细胞分化，抑制其生长起到治疗白血病的作用[14]。韦玉先等[15]的动物实验表明，醋蛋液能明显促进动物肠的蠕动，升高白细胞以及肝脏中锌的含量，提高细胞免疫功能且实验结果未发现醋蛋液有任何不良的影响。

为了探究醋蛋液对巨噬细胞RAW264.7的免疫调节活性，本研究采用细胞计数试剂盒（cell counting kit，CCK）-8法来检测不同剂量的醋蛋液对小鼠巨噬细胞RAW264.7免疫活性的影响，倒置显微镜及荧光显微镜下分别观察不同分组条件下对RAW264.7细胞形态的影响及细胞核的损伤程度，探讨醋蛋液对RAW264.7细胞分泌免疫因子的影响及其免疫调节活性的机理。以期对传统食品的研究和应用、对免疫调节类药物的开发提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜鸡蛋：天津农贸市场；8°梁汾醋：山西梁汾醋业有限公司；RAW264.7巨噬细胞：中科院武汉细胞库；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）试剂盒、NO试剂盒：南京建成生物科技有限公司；IL-1β、TNF-α试剂盒：上海酶联生物科技有限公司；无线电免疫沉淀反应试验（radio immunoprecipitation assay，RIPA）裂解液、JC-1染液、AnnexinV/PI结合液、DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）完全培养基、胰酶（625 U/mL）：赛默飞世尔科技（中国）有限公司；Hoechst33342染料：德国Hoechst AG公司；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）：爱必信（上海）生物科技有限公司；CCK-8：北京盒子生工科技有限公司。

1.2 仪器与设备

3110 CO2细胞培养箱：美国Thermo有限公司；1X2-1LLJ100普通光学显微镜：日本Olympus有限公司；TE2000倒置荧光显微镜：日本Nikon有限公司；C6多功能细胞分析仪：美国BD有限公司；XH-600US 超声波细胞破碎仪：美国Sonics有限公司；1703930电转膜仪：美国Bio-Rad有限公司；Odyssey红外激光成像仪：美国LI-COR生物技术有限公司。

1.3 方法

1.3.1 醋蛋液的制备

选择一个新鲜鸡蛋，用水和体积分数75%乙醇清洗干净，在4 ℃条件下用100 mL 8°梁汾醋浸泡72 h后将蛋液搅拌均匀，充分混合均匀后用两层消毒纱布过滤以除去破碎的蛋膜，置于8 000 r/min条件下离心15 min，取上清液即为醋蛋液，制备的样品保存在20 ℃备用。

1.3.2 醋蛋液剂量筛选

利用CCK-8试剂盒法检测细胞活性从而对醋蛋液的剂量进行筛选。取对数生长期的巨噬细胞RAW264.7约5×104个/mL接种至96孔板中，每孔加入量为100 μL，在不同孔中加入不同质量浓度的样品（2.5 μL/mL、5.0 μL/mL、10.0μL/mL、20.0μL/mL、40.0μL/mL、50.0μL/mL、100.0μL/mL）处理RAW264.7细胞。将96孔板置于37 ℃、5%CO2条件下培养24 h后每孔加入CCK-8溶液10 μL，37 ℃培养箱中避光孵育4 h，终止培养，检测波长450 nm处各孔吸光度值，每个浓度组设置3个平行。细胞活力计算公式如下：

式中：A加药为检测孔（含有细胞、CCK-8和药物溶液）吸光度值；A空白为空白孔（含有培养基和CCK-8溶液）吸光度值；A未加药为空白对照孔（含有细胞和CCK-8溶液）吸光度值。

1.3.3 细胞分组及实验设计

巨噬细胞RAW264.7分成空白组（加入DMEM完全培养基）、乙酸加鸡蛋组（其中乙酸含量参考梁汾醋中含量，浸泡过程如醋蛋液浸泡过程）、水加鸡蛋组、梁汾醋加鸡蛋高剂量组（醋蛋液高剂量组）（20 μL/mL）、梁汾醋加鸡蛋低剂量组（醋蛋液低剂量组）（5 μL/mL）、对照组（加入1 μg/mL的LPS）。

1.3.4 细胞形态观察

取对数生长期的巨噬细胞RAW264.7接种于6孔培养板，置于37 ℃、5%CO2条件下培养24 h后倒去上清液，不同孔中加入不同分组的培养液继续培养24 h后吸去上层细胞培养液，放置在倒置荧光显微镜下观察不同分组条件下的细胞形态变化。

1.3.5 培养液中细胞免疫及体液免疫因子的测定

取对数生长期的细胞RAW264.7接种于6孔培养板，置于37 ℃、5%CO2条件下培养24 h后倒去上清液，空白组、对照组和不同浓度的醋蛋液剂量组中分别加入不同的培养液继续培养24 h，吸取细胞培养液，置于离心机中1 000 r/min离心10 min，取上清液按照NO、IL-1β、TNF-α试剂盒的方法测定培养液中细胞免疫以及体液免疫因子的含量。

1.3.6 细胞核损伤检测

取培养至对数生长期的巨噬细胞RAW264.7，按照5×104个/mL的浓度接种在6孔板中，将不同浓度的醋蛋液样品溶液或LPS处理RAW264.7细胞，置于37 ℃、5%CO2条件下培养24 h。随后倒去上清液每孔中加入2 mL磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution，PBS），此外再向每孔中加入1 μL 1 mg/mL的Hoechst33342染料，37 ℃、5%CO2的培养箱中避光孵育5 min，随后终止培养。吸去染液后用预冷PBS缓缓冲洗细胞2～3次，在倒置荧光显微镜下观察细胞核的损伤情况，并进行拍照。

1.3.7 线粒体膜电位的分析

将培养至对数生长期的RAW264.7细胞以5×104个/mL的密度接种于6孔板中，使用不同浓度的醋蛋液或LPS处理RAW264.7细胞，置于37 ℃、5%CO2条件下培养。用DMEM完全培养基将JC-1染液稀释至质量浓度为5 μg/mL的工作液，每孔2 mL体系，在细胞培养箱37 ℃条件下孵育20 min，去除细胞上清，事先预冷的PBS缓缓冲洗细胞两次，为防止荧光淬灭需要在1 h内完成观察拍照。

1.3.8 AnnexinV/PI细胞凋亡检测

将培养至对数生长期的RAW264.7细胞以5×104个/mL的密度接种于6孔板中，使用不同浓度的醋蛋液或LPS处理RAW264.7细胞，置于37 ℃、5%CO2条件下培养。用200 μL胰酶消化RAW264.7细胞，收集每孔细胞，4 000 r/min离心5 min，用预冷的PBS冲洗2～3次。首先用0.5 mL AnnexinV/PI结合液重悬细胞，后加入5 μL AnnexinV染液，混匀，低温避光条件下孵育15 min；随后再向其中加入5 μL PI染液，混和均匀，低温避光条件下再孵育5 min，此外单独设置单染组以及阳性对照组，防止荧光淬灭需在1 h内上机完成检测。

1.3.9 蛋白免疫印迹检测

将收集好的细胞放入离心管内，4 000 r/min条件下离心5 min，弃去上清后加入1 mL预冷PBS缓冲液重悬，重复以上操作过程洗涤两次，将样品放于冰上。加入0.1 mLRIPA裂解液和1 μL苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）溶液，反复吹打后在冰上充分裂解30 min，期间每隔10 min涡旋一次。低温环境下12 000 r/min离心5 min，采用BCA试剂盒测定制备样品中的总蛋白含量并将样品调成相同浓度，按照样品∶蛋白缓冲液=1∶4的比例加入5倍的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）蛋白上样缓冲溶液并将其混合均匀。100 ℃沸水中反应8 min后冷却离心，取上清按分组分装在500 μL离心管中，放置在-80 ℃环境中保存备用。随后进行凝胶电泳，转膜，孵育相应蛋白对应的一抗与二抗。最后聚偏二氟乙烯（polyvinylidenefluoride，PVDF）膜用Odyssey红外激光成像系统进行成像。用Image J v1.8.0软件对目标带的分子质量和净光密度值进行数据分析。

1.3.10 数据处理

每个样品数据集至少重复3次，使用SPSS 20.0软件进行方差分析和Tukey相关分析。用Origin 9.0绘制图形，实验数据以“平均数±标准差”表示，P＜0.05 表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 醋蛋液对RAW264.7细胞活性的影响

由图1可知，醋蛋液的浓度范围为2.5～100 μL/mL时，巨噬细胞活性呈现先上升后下降的趋势；当醋蛋液浓度为40 μL/mL时，细胞活力极显著升高为（145.3±23.02）%（P＜0.01）。在此之前，当醋蛋液浓度在5～20 μL/mL之间时，细胞活力已经出现了显著差异（P＜0.05）。因此，选择5 μL/mL和20 μL/mL作为低、高剂量进行后续研究。

图1 不同浓度的醋蛋液对巨噬细胞RAW264.7细胞活力的影响Fig. 1 Effect of different concentrations of vinegar egg-juice on cell viability of macrophages RAW264.7

2.2 醋蛋液对RAW264.7细胞形态的影响

由图2可知，正常分组条件下细胞轮廓清晰，呈现较为规则的圆形且增殖能力良好。给药一定剂量的乙酸、鸡蛋以及醋蛋液后巨噬细胞开始出现较低程度的变形，细胞开始呈现梭形以及椭圆形并逐渐长出伪足。乙酸、鸡蛋以及醋蛋液低剂量（5 μL/mL）组间差异不大，但醋蛋液高剂量组（20 μL/mL）相比低剂量组形态变化明显。给药LPS后细胞体积明显变大，呈现不规则状态且具有较高程度的变形，出现较多的突触细胞以及长梭形细胞。细胞膜破损导致细胞液外泄，折光性变差，并可见伸展性较好的伪足。形态结果显示给药LPS可以使巨噬细胞产生典型的炎症相关形态特征并进一步诱发巨噬细胞的炎症相关形态学特征。

图2 醋蛋液对巨噬细胞RAW264.7细胞形态的影响Fig. 2 Effect of vinegar egg-juice on cell morphology of macrophages RAW264.7

2.3 醋蛋液对RAW264.7细胞相关指标的影响

激活后的巨噬细胞可以分泌出不同的趋化因子及细胞因子，在激活机体的适应性免疫和调节免疫反应方面起着非常重要的作用。其中主要由活化的巨噬细胞产生的白细胞介素-1（IL-1）是趋化因子家族的一种细胞因子可以分为IL-1α与IL-1β两种构型。其中IL-1可以激活并参与调节免疫细胞，介导T细胞与B细胞的活化、增殖与分化的过程，在传递信息、免疫反应中起着重要作用[16]。抗肿瘤因子（TNF-α）是一种对肿瘤细胞有杀伤作用而对正常细胞无明显毒性的细胞因子，属于TNF超家族配体。TNF-α是一种多向性的促炎细胞因子，主要由活化的巨噬细胞分化，在自身免疫疾病，类风湿关节炎以及炎症中有着至关重要的作用[17]。

由图3可知，与空白组相比，鸡蛋组与醋蛋低剂量组（5 μL/mL）上清中IL-1β以及TNF-α均未有显著差异（P＞0.05）。但孵育高剂量的醋蛋液（20 μL/mL）和LPS可以显著提高细胞免疫因子IL-1β以及TNF-α的释放（P＜0.05）。与空白组相比，高剂量的醋蛋液组（20 μL/mL）对巨噬细胞分泌IL-1β以及TNF-α的含量分别提高了155.83%和8.81%。一定程度上表明醋蛋液具有一定的免疫调节作用。

图3 醋蛋液对巨噬细胞RAW264.7分泌免疫因子IL-1β（A）、TNF-α（B）及NO（C）的影响Fig. 3 Effect of vinegar egg-juice on secretion of immune factor IL-1β (A), TNF-α (B) and NO (C) of macrophages RAW264.7

NO是由巨噬细胞分泌的一种具有生物活性的细胞信使因子，由NO合成酶（nitric oxide synthase，NOS）合成，是一种具有氧化性能的自由基[18]。NO具有杀灭病原微生物的作用，能够导致肿瘤细胞的凋亡，具有较强的杀伤能力。因而NO被认为是一种细胞内信使分子可以介导各种生物反应的发生，其分泌量是巨噬细胞的免疫活性的评价指标之一。由图3C可知，醋蛋液高剂量组（20 μL/mL）以及LPS组均可以促进巨噬细胞分泌NO，而其他分组孵育巨噬细胞无明显差异（P＞0.05）。

2.4 醋蛋液对RAW264.7细胞核形态的影响

由图4可知，通过荧光显微镜可以看到乙酸组、鸡蛋组以及醋蛋低剂量组（5 μL/mL）与空白组无显著性差异（P＞0.05），属于细胞的正常凋亡。但醋蛋高剂量组（20μL/mL）细胞核染色质浓缩成块或核破碎的情况减少，凋亡细胞数明显减少，有效缓解了细胞损伤程度。随着醋蛋液剂量在5～20 μL/mL增高，细胞损伤情况逐渐缓解，呈现一定的量效关系。LPS诱导的巨噬细胞细胞核脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）出现明显的损伤，并进一步加重核破裂和核染色质浓缩，细胞膜逐渐呈现损伤，结构模糊不清。

图4 醋蛋液对巨噬细胞RAW264.7细胞核形态的影响Fig. 4 Effect of vinegar egg-juice on cell nuclear morphology of macrophages RAW264.7

2.5 醋蛋液对RAW264.7细胞线粒体膜电位的影响

JC-1是一种用于检测细胞及组织线粒体膜电位变化的荧光探针，JC-1染料以电势依赖性的方式聚集在线粒体内，可以通过红绿荧光的变化进行细胞、组织或钝化的线粒体膜电位的监测[19-20]。由图5可知，正常巨噬细胞线粒体中JC-1以聚合物的形式存在，呈现明亮的红色荧光，细胞中的绿色荧光非常弱。加入LPS后在线粒体基质中JC-1不能以聚合物的形式存在，会导致线粒体膜电位下降，从而线粒体内红色荧光强度显著降低（P＜0.05），而细胞浆中绿色荧光显著增强（P＜0.05）。此外红/绿荧光的相对比率的显著降低（P＜0.05），进一步表明线粒体功能受到障碍，细胞受损。与正常组的巨噬细胞相比，乙酸组、鸡蛋组以及醋蛋低剂量组（5 μL/mL）无显著性差异（P＞0.05），属于正常的细胞损伤过程。但乙酸组的红/绿荧光的相对比率相对较低，可能是由于乙酸对细胞具有一定的刺激作用，导致细胞膜电位变低。随着醋蛋液剂量的增加，醋蛋液高剂量（20 μL/mL）处理的细胞与正常的巨噬细胞以及LPS处理的细胞相比细胞内的绿色荧光强度逐渐减弱，红色荧光逐渐增强，可以缓解细胞膜电位降低造成的细胞损伤。崔晓枫[21]研究发现，黄伞菌的次级代谢产物在质量浓度为100 μg/mL时作用于巨噬细胞RAW264.7，细胞核出现致密浓染且有颜色发白的碎片的现象。且经过黄伞菌次级代谢产物孵育后红色荧光逐渐减少，绿色荧光逐渐增加，膜电位下降，对巨噬细胞有一定的损伤作用。

图5 醋蛋液对巨噬细胞RAW264.7细胞膜电位的影响Fig. 5 Effect of vinegar egg-juice on cell membrane potential of macrophages RAW264.7

2.6 醋蛋液对RAW264.7细胞凋亡的影响

由图6可知，右下象限和右上象限分别表示凋亡细胞和坏死细胞，左下象限表示活细胞。乙酸与LPS处理后的细胞凋亡率（膜联蛋白V+细胞/总细胞）显著上升（P＜0.05），分别达到（25.5±1.89）%和（29.3±3.01）%，说明乙酸以及LPS均对巨噬细胞有一定的损伤作用。鸡蛋处理的巨噬细胞与正常细胞无异，高剂量的醋蛋液（20 μL/mL）可减少细胞的凋亡，可缓解巨噬细胞的凋亡，对细胞具有一定的保护作用。且随着醋蛋液剂量的增加，保护效果越明显，具有一定的量效关系。介怡琳等[22]也研究发现，从鸡蛋蛋黄中提取的不同浓度的卵黄高磷蛋白均可以促进巨噬细胞RAW264.7的增殖并起到抑制细胞凋亡的作用，但质量浓度为100 μg/mL时效果最佳。

图6 醋蛋液对巨噬细胞RAW264.7细胞凋亡的影响Fig.6 Effect of vinegar egg-juice on apoptosis of macrophages RAW264.7

2.7 醋蛋液对RAW264.7细胞免疫相关蛋白表达的影响

醋蛋液对巨噬细胞RAW264.7免疫相关蛋白（蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）、磷酸化蛋白激酶B（phosphorylation of protein kinase B，P-AKT）、NF-κB、磷酸化（P）-NF-κB、3-磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehydes-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH））表达情况见图7。

图7 醋蛋液对免疫相关蛋白表达水平的影响Fig. 7 Effect of vinegar egg-juice on expression levels of immune-associated protein

由图7可知，给药高剂量醋蛋液（20 μL/mL）以及鸡蛋，巨噬细胞中AKT以及NF-κB的蛋白表达量明显高于空白组但相比LPS组较低。一定程度上表明醋蛋液和鸡蛋都具有一定的免疫调节活性，但醋蛋液的效果明显高于鸡蛋。与空白组相比，醋蛋液高剂量组（20 μL/mL）对AKT及NF-κB的蛋白表达量分别增加了28.98%和31.27%。这些结果说明激活NF-κB和AKT通路参与醋蛋液激活巨噬细胞，进而调节机体免疫[23-25]。

3 结论

本研究考察了不同剂量醋蛋液对巨噬细胞细胞形态和细胞核形态的影响，结果表明，高剂量醋蛋液（20 μL/mL）可使细胞折光性变强，细胞形态变化明显；高剂量醋蛋液可以明显减少细胞凋亡的数量，有效缓解了细胞核损伤程度；高剂量醋蛋液可显著增强细胞免疫因子IL-1β以及TNF-α的释放。高剂量醋蛋液可提高巨噬细胞中NF-κB和AKT关键蛋白表达量，其分别上调了28.98%和31.27%，表明高剂量醋蛋液通过激活免疫通路，以强化巨噬细胞免疫能力。此研究对免疫调节类药物的开发提供了新思路，在未来医药领域潜力巨大，同时对传统食品的研究和应用提供了新思路。