高效液相色谱法测定万应跌打酒中士的宁含量

陈继英，蓬展鹏，吴 谋，莫楚铭

（广东省东莞市中医院，广东 东莞 523000）

万应跌打酒由醋乳香、醋没药、当归尾、制马钱子、骨碎补、栀子等22 味中药经现代工艺提取制成，用于治疗跌打损伤、气滞血瘀痹症，疗效确切。该酒剂2017年再注册批件中的审评意见为“申报单位应继续对士的宁的限度检查方法进行研究，并列入标准”。但目前士的宁含量测定中的对照品为士的宁[1]，中国食品药品检定研究院网站中国家药品标准物质特殊标准物质显示，乌头碱、士的宁、马钱子碱均属剧毒类危险化学品，应暂时停止供应。为保证用药安全，本研究中以马钱子总生物碱对照品为对照，参照《中国药典》标准，采用高效液相色谱（HPLC）法对万应跌打酒处方中有毒药味制马钱子进行士的宁的限量检测，并拟订样品中士的宁毒性限度的检查范围。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260 Infinity 型高效液相色谱仪，包括紫外检测器（美国安捷伦科技公司）；AUW120D 型电子分析天平（日本岛津公司，精度为十万分之一）；PL-S30T 型超声波清洗仪（东莞康士洁超声波科技有限公司）。

1.2 试药

万应跌打酒（东莞市中医院制剂室，批号分别为20190102，20190408，20190601）；马钱子总生物碱对照品（中国食品药品检定研究院，批号为112030-201601，含马钱子碱45.40%、士的宁49.90%）；乙腈、磷酸二氢钾、庚烷磺酸钠、磷酸（色谱纯，德国Merck公司）；三氯甲烷（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

参照2015年版《中国药典（一部）》“马钱子含量测定”项，马钱子碱、士的宁的检测波长为260 nm[1]；马钱子碱、士的宁的流动相为乙腈-0.01 moL/L 庚烷磺酸钠与0.02 moL/L 磷酸二氢钾等量混合溶液（用10%磷酸调pH 至2.8）（21 ∶79，V/ V）[2-5]；理论板数按士的宁峰计应不低于5000；预试验中色谱柱Agilent SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）分离度尚可，但理论板数不足5000，后更换为AgilentTC-C18柱（250mm×4.6mm，5 μm），符合要求；流速为1.0 mL/min；柱温为250 ℃；进样量为10 μL。

2.2 溶液制备

混合对照品溶液：取马钱子总生物碱对照品3.0 mg，精密称定，置10 mL 容量瓶中，加三氯甲烷溶解，并用甲醇定容，摇匀，即得每1 mL 含马钱子碱0.1362 mg、士的宁0.1497 mg 的混合对照品溶液。

供试品溶液：取样品10 mL，置具塞锥形瓶中，加入0.5%盐酸溶液10 mL，混匀，超声（功率250 W，频率40 kHz）处理30 min，移至分液漏斗中，锥形瓶用0.5%盐酸溶液10 mL 反复洗涤，合并洗液，加浓氨试液调pH至9 ～10，用三氯甲烷振摇提取3 次，每次20 mL；合并三氯甲烷提取液，蒸干，残渣加甲醇10 mL 溶解，摇匀，经0.45 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

阴性对照品溶液：取不含制马钱子的样品10 mL，按供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察[6-9]

专属性考察：按2.1 项下色谱条件，取阴性对照品溶液、混合对照品溶液、供试品溶液各适量，进样测定，色谱图见图1。结果阴性对照无干扰，表明方法专属性良好。

图1 高效液相色谱图1.brucine 2.strychnine A.Negative reference solution B.Mixed reference solution C.Test solutionFig.1 HPLC chromatograms

线性关系考察：取马钱子总生物碱对照品3.0 mg，精密称定，置10 mL 容量瓶中，加三氯甲烷适量溶解，并用甲醇定容，摇匀，即得每1 mL 含马钱子碱0.1013 mg、士的宁0.1140 mg 的溶液，依次稀释，得马钱子碱质量浓度为81.04，60.78，50.67，25.33，12.66 μg / mL和 士 的 宁 质 量 浓 度 为91.21，68.41，55.70，27.85，13.92 μg / mL 的系列混合对照品溶液，精密量取上述系列混合对照品溶液各10 μL，按2.1 项下色谱条件进样测定，以峰面积为纵坐标（Y）、士的宁质量浓度为横坐标（X）进行线性回归，得回归方程Y=19.394X+2.9418（r=0.9997，n =5）。结果表明，士的宁质量浓度在13.92 ～114.02 μg / mL 范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：取2.2 项下混合对照品溶液适量，按2.1 项下色谱条件进样测定6 次，记录峰面积。结果的RSD为0.17% （n =6），表明仪器 精 密度良好。

重复性试验：取样品（批号为20190102）适量，按2.2 项下方法制备供试品溶液6 份，再按2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积，计算士的宁含量。结果的RSD为1.58%（n =6），表明方法重复性良好。

稳定性试验：取2.2 项下供试品溶液（批号为20190102）适量，分别于室温下放置0，2，4，8，12，16，22，24 h 时按2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果的RSD为1.20（n=8），表明室温下供试品溶液在24 h 内基本稳定。

加样回收试验：取样品（批号为20190102，士的宁含量为32.55 μg / mL）6 份，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入马钱子总生物碱对照品溶液（每1 mL含马钱子碱0.2027 mg / mL、士的宁0.2228 mg/mL）1 mL，按2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算回收率。结果见表1。

耐用性试验[10]：取样品（批号为20190102）适量，按2.2 项下方法制备供试品溶液，并按2.1 项下色谱条件分别设置色谱柱，包括卡赛帕克MGII 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；迪马Diamonsil 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；Waters RP18 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。结果的RSD为0.90%，显示色谱柱发生一定程度变化时，本方法能满足试验要求，耐用性良好。

表1 士的宁加样回收试验测定结果（n=6）Tab.1 Results of recovery tests of strychnine（n=6）

2.4 样品含量测定

取3 批样品（批号分别为20190102，20190408，20190601）各适量，依法制备供试品溶液，按2.1 项下色谱条件进样测定，并平行测定3 次，记录峰面积，并计算样品含量。结果3 批样品中士的宁含量分别为31.8，32.1，33.0 μg/mL，平 均32.3 μg/mL，RSD分 别 为1.30%，1.50%，2.20%。

2.5 样品中士的宁毒性限度检查范围确定

依据2015年版《中国药典（一部）》马钱子粉项下规定，士的宁含量限度不得过0.82%，其“用法用量”项下规定，马钱子的服用量为0.6 g，折算后士的宁每天服用量约为4.92 mg，为每天最大安全服用量[11-12]。用马钱子粉中士的宁的每天最大安全服用量除以万应跌打酒的平均含量，得出万应跌打酒每天最大使用量不能超过152 mL。

根据样品的用法用量，每天使用3 次，每次常用量为10 mL，每天的常规使用量为30 mL。按马钱子粉的理论安全服用量的最大值计算，万应跌打酒每1 mL 含士的宁应不得超过164 μg。为保证临床用药安全，减少不良反应，按2015年版《中国药典（一部）》马钱子粉项下士的宁含量限度计算，并结合实际的试验结果，初步拟订万应跌打酒士的宁最高限度范围为每1 mL 含士的宁不得超过100 μg。

3 讨论

中医把凡因外力作用于人体而引起的筋骨伤损、瘀血肿痛、气血不和、经络不通以至脏器受损等统称为跌打损伤[13]。万应跌打酒用于治疗跌打损伤（现代医学又称急性软组织损伤）。处方中的制马钱子味辛、性温，可散寒温通经络，消肿散结止痛；主要有效成分为生物碱，生物碱中含量较高的为士的宁和马钱子碱，既是有效成分又是有毒成分，故需对含制马钱子制剂的毒性成分进行限度检查，以确保临床用药的安全性。制马钱子的毒性反应主要由超安全剂量口服引起，口服马钱子碱中毒剂量为15 ～100 mg（平均50 mg）。马钱子中毒剂量与治疗剂量非常接近，须合理应用，以避免中毒反应及确保疗效[14]，尤其是应规范此类含有大毒药味的中药制剂的临床用药[15]。