Box-Behnken设计优化阳离子交换色谱分离牛初乳中乳铁蛋白的工艺研究

刘佳欣，贺梦瑶 ，汤兴楠，栾凯雯

（沈阳化工大学制药与生物工程学院，辽宁 沈阳 110142）

乳铁蛋白（Lactoferrin，LF）是一种铁结合性糖蛋白，相对分子质量约为 80 kDa[1]，最早是由Sorensen（1939）在牛乳中一个未知的“红色组分”中发现[2]。乳铁蛋白在乳中的含量最为丰富，特别是在初乳中含量较高，人初乳中乳铁蛋白的质量浓度可达到7 mg·mL-1,牛初乳中乳铁蛋白的质量浓度平均为1 mg·mL-1[3]。

乳铁蛋白作为多功能糖蛋白具有多种生物活性，抗病毒、抗癌[4]、抗氧化、调节机体免疫反应[5],还具有抑菌功能[6-7]，对肠道菌群的有一定调节作用。目前分离乳铁蛋白的方法有很多种，如凝胶过滤层析法、膜分离法，亲和色谱法[8-10]等。凝胶过滤层析操作简便所需设备简单，并且层析所用的凝胶属于惰性载体，不会影响分离物。但凝胶过滤层析对流速要求较高，且对于分子量相差不多的物质难以达到很好的分离效果[11]。由于LF 的热稳定性差，而膜分离法是一个不需要加热，并且不需要化学试剂的分离方法，因此可以最大限度地保持LF 的生物活性，但膜容易堵塞，不易清洗，分离成本高[12-13]。亲和色谱法是一种新兴的分离技术，该技术通过利用固定相的结合特性实现对分子的分离，抗体与抗原作用专一性高、亲和力强，可实现一步分离.但操作费用昂贵，不能用于工业化[14]。本试验试验采用阳离子交换色谱CM-Sepharose fast flow 分离牛初乳中的乳铁蛋白，并对其分离条件进行优化，得到最佳的分离条件。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

95%乳铁蛋白，biotopped 公司；牛初乳，木兰花乳业奶牛养殖场；CM-Sepharose fast flow 5 mL，通用电气公司；盐酸，磷酸二氢钠，磷酸氢二钠，均为分析纯，西陇化工股份有限公司。

1.2 仪器与设备

AKTA purifier，通用电气公司；高速冷冻离心机,赛默飞世尔科技有限公司；Synergy2 多功能酶标仪，美国伯腾仪器有限公司；HH4 型数显恒温水浴锅, 金坛市天瑞仪器有限公司；GB1302 型电子精密天平，梅特勒托利多仪器公司；SHZ-D (Ⅲ)循环水式真空泵，巩义市予华仪器责任公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品预处理

将牛初乳装入100 mL 离心管中，以10 000 r·min-14 ℃离心30 min，除去上层脂肪；加入1 mol·L-1的稀盐酸，缓慢添加调至牛初乳溶液pH 为4.6，水浴加热40 ℃，保温30 min，然后放入高速冷冻离心机中，以10 000 r·min-140 ℃离心30 min，保留上层乳清蛋白，将得到乳清蛋白溶液；

进行抽滤，得到的粗样品，用0.45μm 的微孔滤膜过滤，得到纯净的样品。

1.3.2 色谱条件

色谱柱：CM-sepharose fast flow 预装柱5 mL；流动相：A 溶液（pH 值为7.0，浓度为0.02 mol·L-1的磷酸缓冲盐溶液）；B 溶液（pH 值为7.0，浓度为1 mol·L-1NaCl 混合溶液）；洗脱速度1 mL·min-1；进样量: 1 mL，上样速度1 mL·L-1；紫外检测器，检测波长280 nm、475 nm。

1.4 单因素试验

以起始缓冲液pH7、洗脱液浓度1 mol·L-1、洗脱速度1 mL·min-1、上样速度1 mL·min-1为基本条件，通过改变单一因素来探讨其对乳铁蛋白得率的影响。起始缓冲液分别为6.0、6.5、7、7.5、8.0；洗脱液浓度0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mol·L-1、洗脱速度0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL·min-1; 上样速度0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL·min-1。

1.5 响应面优化试验

在单因素试验的基础上，根据Box-Behnken 试验设计原理，采用Design-Expert 软件，以乳铁蛋白的得率为影响值进行响应面优化，响应面因素和水平见表1。

表1 响应面因素和水平表

1.6 乳铁蛋白得率的测定方法

乳铁蛋白得率（%）=乳铁蛋白峰面积÷总蛋白峰面积×100%。

1.7 数据分析

所有试验设置3 次重复，并通过SPSS17.0 软件统计进行数据方差分析，p＜0.01 差异具有显著统计学意义，试验结果用作图软件origin9.0 绘图。

2 结果与分析

2.1 穿透曲线的绘制

标准乳铁蛋白的在CM-Sepharose fast flow 离子交换色谱上的穿透曲线如图 1。试验在流速1 mL·min-1下进样, 由图1 可见上样体积达到1 mL时达到穿透点, 2 mL 左右CM-Sepharose fast flow 离子交换色谱吸附基本达到饱和，之后吸附作用开始减弱，由此计算得到, 进样2 mL 左右可以使预装柱充分吸附, 因此确定最大上样量为100 μg·mL-1。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 起始缓冲液pH 对乳铁蛋白得率的影响

图1 CM-Sepharose fast flow 穿透曲线

图2 起始缓冲液对乳铁蛋白得率的影响

当起始缓冲液pH 在6.0～6.5 时，乳铁蛋白得率降低，见图2，这是因为当起始缓冲液pH 值为6.5时，洗脱时需要高浓度的盐溶液才可以将乳铁蛋白洗脱下来，因此乳铁蛋白得率降低。当起始缓冲液的 pH 为 8.0 时, 乳铁蛋白基本无法吸附在CM-Sepharose fast flow 色谱柱上，乳铁蛋白会与部分杂蛋白等组分一起率先被洗脱下来，此时的乳铁蛋白得率不高[15-16]。

2.2.2 洗脱液浓度对乳铁蛋白得率的影响

洗脱液NaCl 浓度在0.6～1.0 mol·L-1时，洗脱液浓度越大，乳铁蛋白得率越高，当洗脱液浓度为 0.8 mol·L-1时乳铁蛋白得率最高，见图3。当洗脱液浓度继续升高，乳铁蛋白得率下降，这可能是因为少部分乳过氧化物酶被洗脱下来。乳过氧化物酶等电点9.0，高于乳铁蛋白的等电点，与离子交换介质的相互作用力强于乳铁蛋白。洗脱液浓度过大，乳过氧化物酶的相互作用力减弱，也被洗脱下来，导致乳铁蛋白得率降低[17-19]。

2.2.3 洗脱速度对乳铁蛋白得率的影响

由图4 可以发现，洗脱速率为 1.0 mL·min-1的情况下，得到乳铁蛋白得率最高，而低于或高于此浓度的洗脱流速情况下，CM-Sephadrose fast flow 色谱柱吸附乳铁蛋白的未能及时被洗脱下来，使得乳铁蛋白得率低。

图3 洗脱液浓度对乳铁蛋白得率的影响

图4 洗脱速度对乳铁蛋白得率的影响

2.2.4 上样速度对乳铁蛋白得率的影响

上样速率在 0.4～0.8 mL·min-1时，上样速率对乳铁蛋白得率无明显影响，上样液中的乳铁蛋白可以充分扩散到CM-Sepharose fast flow 色谱柱表面。上样速率超过0.8 mL·min-1后，乳铁蛋白的得率开始下降，这是因为上样速率过快，样品中的乳铁蛋白未及时被离子交换剂表面吸附就从层析柱中冲出，造成乳铁蛋白流失[20-22]。

图5 上样速度对乳铁蛋白得率的影响

2.3 响应面优化试验结果

2.3.1 回归模型的构建及方差分析

乳铁蛋白分离试验设计方案以及结果见表2，回归方差分析见表3，拟合所得多元二次回归方程Y=84.94+0.33A+0.36B+0.23C+0.14D+0.29AB-0.49A C+0.32AD+0.39CD-2.62A2-2.50B2-1.51C2-0.98D2。

表2 响应面试验设计和试验结果

由表3 数据可知，该回归模型达到极显著水平（p＜0.01），说明该方法是可靠的；失拟项不显著，R2=0.987 9，表明此模型的拟合程度良好，乳铁蛋白得率可以用该模型进行分析和预测。通过对比表3中的F值可以看出，影响乳铁蛋白得率的主次顺序为：B＞A＞C＞D，即洗脱速度＞起始缓冲液pH＞洗脱液浓度＞上样浓度。

表3 回归模型方差分析表

2.3.2 各因素之间的交互作用

根据回归方程做出的各两因素交互作用的响应面分析图见图6。起始缓冲液pH（A）和洗脱速度（B）交互作用对乳铁蛋白得率的影响显著。起始缓冲液pH（A）和洗脱液浓度（C）交互作用对乳铁蛋白的得率的影响显著。洗脱液浓度（C）和上样速度（D）交互作用对乳铁蛋白得率的影响显著。

2.3.3 最优条件的确定及验证实验

用Design-Expert8.06 软件对二次多项式回归方程进行计算，得到阳离子交换色谱法分离乳铁蛋白的最优制备工艺条件为：起始缓冲液pH7.03，洗脱速度1.01 mL·min-1, 洗脱液浓度1.01 mol·mL-1, 上样速度0.82 mL·min-1, 乳铁蛋白得率的理论最优值为84.98%。参照此条件进行验证试验，得到乳铁蛋白得率为84.43%，理论值的相对误差为0.55%，说明该方法具有一定的实际可操作性。

3 讨论

乳铁蛋白作为一种新兴功能性食品配料，具有很高的营养价值。

图6 各两因素交互作用的响应面

近年来，乳铁蛋白的分离纯化工艺不断提高，已成功应用于酸奶、婴幼儿配方奶粉等产品中[23]。杨安树[24]等采用 CM-Sepharose fast flow 阳离子交换柱对经脱脂、酪蛋白沉淀及超滤后的预处理样品进行进一步分离，得到纯度为95%的乳铁蛋白。任璐等[25]对流动相不同pH 值对分离效果的影响作了分析并得出相似结论，pH 值在7.0～7.3 之间的流动相较为适宜，能够较好地分离LF 与其他杂蛋白。可见通过此方法能很好地分离牛初乳中的乳铁蛋白，为乳铁蛋白的纯化奠定了基础。