13种藜麦萌发期抗逆性综合评价

王志恒，黄思麒，李成虎，周吴艳，胡 韩，徐中伟，马维亮，魏玉清

(1北方民族大学 生物科学与工程学院,国家民委生态系统模型及应用重点实验室，宁夏 银川 750021；2宁夏回族自治区 海原县农业技术推广服务中心,宁夏 中卫 755299；3宁夏农林科学院,宁夏 银川 750000)

藜麦(ChenopodiumquinoaWilld.)为苋科藜亚科藜属一年生双子叶植物，距今已有7 000多年的人工种植史[1]。藜麦耐寒、耐旱、耐盐碱和耐贫瘠，籽粒中蛋白质含量高，氨基酸比例协调，富含维生素(A、B2、E)和矿物质(Ca、Fe、Cu、Mg、Zn)，有“粮食之母”、“黄金谷物”、“神圣的食物”等称号，备受国内外农业和食品专家以及消费者的关注[2-5]。因此，研究藜麦对改善人类膳食营养水平和发展未来农业生态系统具有十分重要的意义。

种子萌发期是植物生长发育过程中对外界环境最敏感的时期，逆境条件下种子在萌发阶段的表现对植物的群体数量和结构具有决定作用[6]。因此许多学者都非常重视植物该时期的抗逆性研究。王春语等[7]利用1.2%的NaCl模拟盐胁迫对高粱萌发期耐盐材料进行筛选与鉴定，最终筛选出5份耐盐能力强的高粱品种。王焱等[8]利用PEG-6000模拟干旱胁迫进行苜蓿种质资源萌发期抗旱指标筛选，同时采用主成分分析和相关性分析等方法进行抗旱性综合评价，发现根长、发芽率和活力指数可作为苜蓿品种抗旱性鉴定的主要指标，并筛选出3份抗旱能力强的苜蓿品种。徐宁等[9]利用50 mmol/L混合碱(NaHCO3和Na2CO3)模拟碱胁迫环境进行绿豆品种资源萌发期的耐碱性鉴定，采用主成分分析和聚类分析进行耐碱性评价，发现萌发指数、下胚轴干质量、胚根长可作为绿豆萌发期耐碱性的鉴定指标，最终筛选出9份耐碱能力强的绿豆品种。目前对小麦[10-11]、玉米[12-13]、水稻[14-15]、高粱[16-17]等作物的抗逆性评价较多，藜麦虽是公认的抗逆性较强的作物之一，但对其萌发期抗逆性的综合评价研究较少，对其抗逆性评价指标也未见探讨。为此，本研究以PEG-6000模拟干旱胁迫、NaCl模拟盐胁迫、混合碱(NaHCO3和Na2CO3)模拟典型碱胁迫环境，采用主成分分析、热图和聚类分析方法，对13个藜麦品种萌发期性状进行综合鉴定，筛选抗旱、耐盐碱能力强的藜麦品种及其主要鉴定指标，以期为藜麦抗逆基因发掘与种质创新提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试13种藜麦种子由宁夏农林科学院马维亮研究员提供，品种信息见表1。

表1 供试藜麦品种编号及来源

1.2 试验处理

试验于2019年5月在北方民族大学生物科学与工程学院植物生理生态实验室进行。挑选饱满、色泽和大小基本一致的藜麦种子，以体积分数10% NaClO3溶液消毒20 min后，无菌水冲洗至干净无味，用滤纸吸干种子表面水分，铺在放有双层滤纸的培养皿中，每个培养皿摆放30粒种子，作好标记。为了确定藜麦品种萌发期抗逆性的适宜剂量，预试验中设置6个PEG-6000梯度，分别为0(CK，蒸馏水)，-0.12，-0.24，-0.36，-0.48，-0.60 MPa；6个NaCl梯度，分别为0(CK，蒸馏水)，50，100，200，300，400 mmol/L；6个混合碱梯度(NaHCO3与Na2CO3物质的量比为9∶1)，分别为0，(CK，蒸馏水)，10，20，30，40，50 mmol/L。经过观察并统计藜麦发芽数和早期幼苗生长状况发现，在-0.36 MPa PEG-6000、300 mmol/L NaCl、40 mmol/L混合碱分别处理下，各品种间生长指标的差异较为明显，故确定其为藜麦抗逆性试验的适宜剂量。将10 mL适宜剂量的处理液加入到摆放好藜麦种子的培养皿中，对照加10 mL蒸馏水，每处理重复3次，将所有培养皿置于“12 h(25 ℃)光照/12 h(20 ℃)黑暗”的人工气候培养箱中进行萌发试验，试验期间每天更换培养液，以保证培养环境的恒定。

1.3 测定指标及方法

试验过程中，每隔24 h观察记录种子萌发情况，以胚根伸出种皮2 mm为萌发标准，记录种子萌发数，计算发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数。7 d后结束萌发，从每个处理中随机选出10株幼苗，以植株根与茎的分节点为起点测量幼苗芽长和根长(总长=芽长+根长)，用电子分析天平测定幼苗鲜质量和干质量(幼苗先105 ℃烘2 h杀青，再80 ℃烘至恒质量)。为了方便各品种间比对，下述指标均以其相对值(以对照为基准)反映不同品种对逆境胁迫的响应程度[9]。

发芽率=萌发种子数/供试种子数×100%。

发芽势=第3天发芽种子数/供试种子数×100%。

发芽指数=∑Gt/t。

活力指数=∑Gt/t×S。

式中：Gt为t天内发芽的种子数；t为相应的萌发时间，d;S为平均长度,mm。

1.4 数据处理

采用Microsoft Excel 2003进行数据统计处理，数据以“平均值±标准差”表示。用SPSS satatistic 21.0进行主成分分析和相关性分析，JMP 13.0软件进行聚类分析，R语言(www.r-project.org)Pheatmap包(https://CRAN.R-project.org/package=pheatmap) 完成热图分析，GraphPad Prism 5.0进行显著性差异分析。

2 结果与分析

2.1 逆境胁迫对不同品种藜麦萌发的影响

2.1.1 干旱胁迫 由表2可知，在-0.36 MPa PEG-6000模拟干旱胁迫下，13个藜麦品种萌发期各性状的相对值除部分品种的干质量、发芽率外，其他指标均小于100%，且不同品种的降低幅度不同。13个藜麦种子相对发芽率为81.78%～107.86%，相对发芽势为78.09%～99.54%，相对发芽指数为69.40%～92.55%，相对活力指数为17.28%～75.23%，相对芽长为50.47%～85.20%，相对根长为17.87%～99.73%，相对总长为25.18%～93.86%，相对鲜质量为43.66%～77.86%，相对干质量为103.86%～148.50%。从表2还可以看出，干旱胁迫下13个藜麦品种的相对发芽率、相对发芽势和相对发芽指数均无显著差异；品种Q2、Q5、Q11、Q12的活力指数、芽长、根长、总长、鲜质量和干质量相对值较大，表现出较强的抗旱性；品种Q6、Q7、Q8上述指标的相对值较小，抗旱性较弱。

表2 干旱胁迫下13种藜麦萌发期各指标的相对值

2.1.2 盐胁迫 由表3可知，在300 mmol/L NaCl模拟盐胁迫下，13个藜麦品种萌发期各性状相对值除部分品种的发芽率、发芽势、发芽指数、根长和干质量外，其他指标均小于100%，且不同品种降低幅度存在差异。13个藜麦种子的相对发芽率为75.00%～111.79%，相对发芽势为88.24%～112.67%，相对发芽指数为56.12%～101.50%，相对活力指数为17.41%～91.28%，相对芽长为51.89%～81.82%，相对根长为7.09%～115.45%，相对总长为20.89%～99.73%，相对鲜质量为64.16%～97.02%，相对干质量为63.91%～103.21%。从表3可以看出，盐胁迫下品种Q6、Q7、Q8各指标相对值较大，表现出较强的耐盐性；品种Q5、Q13各指标相对值较小，耐盐性较弱。

2.1.3 碱胁迫 由表4可知，在40 mmol/L混合碱胁迫下，13个藜麦品种萌发期的相对根长和相对干质量均小于100%，其他指标因品种不同有所升高或降低。13个藜麦种子的相对发芽率为70.27%～107.36%，相对发芽势为82.50%～129.31%，相对发芽指数为91.35%～135.74%，相对活力指数为30.26%～123.12%，相对芽长为83.79%～154.86%，相对根长为13.91%～91.09%，相对总长为27.75%～109.99%，相对鲜质量为83.91%～157.75%，相对干质量为49.97%～88.10%。从表4可以看出，碱胁迫下13个藜麦品种萌发期的相对发芽率、相对发芽势和相对发芽指数均无显著差异，其中品种Q6、Q7、Q8和Q1各指标相对值较大，表现出较强的耐碱性；品种Q3和Q5各指标相对值较小，表现出较弱的耐碱性。

表3 盐胁迫下13种藜麦萌发期各指标的相对值

表4 碱胁迫下13种藜麦萌发期各指标的相对值

表4(续) Continued table 4

2.2 13种藜麦萌发期抗逆性的主成分分析

2.2.1 抗旱性 主成分与其他指标之间的相关系数(载荷矩阵)反映了某指标对主成分负荷的相对大小和作用方向，相关系数绝对值越大，说明关系越密切。由表5和表6可知，13种藜麦萌发期抗旱性前2个主成分的累积贡献率达到82.24%，所以提取前2个主成分替代9个指标来评价其抗旱性。第Ⅰ主成分的贡献率为55.46%，其中相对鲜质量(X8)、相对根长(X6)和相对总长(X7)的相关系数较大，说明其在第Ⅰ主成分上有较大载荷，可以反映干旱胁迫下藜麦早期幼苗的生长状况；第Ⅱ主成分的贡献率为26.78%，以相对发芽势(X2)和相对发芽指数(X3)的载荷较大，可以反映干旱胁迫下藜麦的萌发状况。

表5 藜麦萌发期主成分的特征值及贡献率

表6 藜麦萌发期抗逆性主成分分析中各因子的载荷矩阵

2.2.2 耐盐性 由表5和表6可知，13种藜麦萌发期耐盐性前3个主成分的累积贡献率达到85.60%，所以提取前3个主成分替代9个指标来评价藜麦萌发期耐盐性。第Ⅰ主成分的贡献率为44.16%，其中相对根长(X6)和相对总长(X7)的载荷较大，反映了盐胁迫下藜麦早期幼苗的生长状况；第Ⅱ主成分的贡献率为29.53%，其中相对发芽率(X1)和相对发芽势(X2)具有较大载荷，可以反映盐胁迫下幼苗的萌发状况；第Ⅲ主成分的贡献率为11.92%，以相对鲜质量(X8)和相对干质量(X9)的载荷较大，反映了盐胁迫下幼苗的生长发育状况。

2.2.3 耐碱性 由表5和表6可知，13种藜麦萌发期耐碱性前3个主成分的累积贡献率达到84.65%，所以提取前3个主成分替代9个指标来评价藜麦萌发期的耐碱性。第Ⅰ主成分的贡献率为43.60%，其中相对根长(X6)和相对总长(X7)的载荷较大，反映了碱胁迫下藜麦早期幼苗的生长状况；第Ⅱ主成分的贡献率为26.67%，相对发芽势(X2)在第Ⅱ主成分具有较大载荷；第Ⅲ主成分的贡献率为14.38%，其中相对鲜质量(X8)的载荷较大。

结合主成分中每个指标所对应的相关系数(特征向量)，参照林海明等[18]的方法，以特征向量为权重分别构建藜麦萌发期抗旱性、耐盐性和耐碱性的主成分函数表达式。

抗旱性函数表达式：

Y1=-0.045X1-0.070X2-0.064X3+0.166X4+0.202X5+0.220X6+0.230X7+0.221X8+0.158X9;

Y2=0.323X1+0.343X2+0.334X3+0.098X4-0.082X5-0.045X6-0.085X7-0.037X8+0.032X9。

耐盐性函数表达式：

Y1=0.058X1-0.014X2-0.042X3+0.302X4+0.050X5+0.359X6+0.352X7-0.069X8-0.101X9;

Y2=0.418X1+0.368X2+0.225X3+0.076X4-0.293X5+0.006X6-0.012X7-0.018X8-0.003X9;

Y3=-0.239X1-0.110X2+0.143X3-0.030X4+0.502X5-0.120X6-0.081X7+0.427X8+0.441X9。

耐碱性函数表达式：

Y1=-0.008X1-0.082X2-0.040X3+0.344X4-0.082X5+0.412X6+0.368X7-0.054X8-0.161X9;

Y2=0.309X1+0.377X2+0.369X3+0.070X4-0.056X5-0.075X6-0.080X7+0.008X8+0.051X9;

Y3=0.036X1+0.041X2-0.067X3-0.109X4+0.415X5-0.126X6-0.037X7+0.422X8+0.440X9。

式中：Yi(i=1,2,3)为主成分，X1～X9分别为发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数、芽长、根长、总长、鲜质量和干质量的相对值。

利用单一的Y1、Y2或Y3无法对藜麦萌发期的抗逆性做出综合评价，故以每个主成分贡献率占所提取主成分累积贡献率的比例作为权重计算主成分综合模型，得到其抗旱性模型为：Y=0.674Y1+0.326Y2；耐盐性模型为：Y=0.516Y1+0.345Y2+0.139Y3；耐碱性模型为：Y=0.515Y1+0.315Y2+0.170Y3。根据模型计算得到13种藜麦萌发期抗旱性、耐盐性和耐碱性的主成分综合得分见表7。

表7 13种藜麦品种抗逆性综合因子得分及排序

由表7可见，13个藜麦品种的抗旱性从强到弱依次为：陇藜3号>嫁祺2号>钻石1号>南非2号>陇藜2号>贺兰太行藜麦>陇藜1号>青海1号>DACE>HTH-01>南非1号>陇藜4号>HTH-y605；耐盐性从强到弱依次为：HTH-01>HTH-y605>陇藜4号>南非2号>贺兰太行藜麦>DACE >陇藜2号>嫁祺2号>陇藜1号>南非1号>钻石1号>青海1号>陇藜3号；耐碱性从强到弱依次为：HTH-y605>陇藜4号> HTH-01>南非1号>DACE>贺兰太行藜麦>陇藜2号>嫁祺2号>青海1号>南非2号>钻石1号>陇藜1号>陇藜3号。对13个藜麦品种抗旱性、耐盐性和耐碱性的主成分综合得分值进行相关性分析，发现抗旱性与耐盐性的相关系数为-0.664(P<0.05)，抗旱性与耐碱性的相关系数为-0.941(P<0.01)，耐盐性与耐碱性的相关系数为0.707(P<0.01)。

2.3 藜麦萌发期抗旱性、耐盐性和耐碱性的热图及聚类分析

为了直观分析13种藜麦萌发期9个指标在不同逆境胁迫下的变化情况，利用热图对不同逆境胁迫下藜麦萌发期性状的变化量进行可视化处理，通过横向聚类反映不同藜麦品种在某一逆境胁迫下的变化情况，用纵向聚类反映9个指标在某一逆境胁迫下的相互关系。热图中颜色越接近红色，表示相对值越高；越接近绿色，表示相对值越低。13个藜麦品种萌发期9个指标相对值的变化热图及聚类分析结果见图1～3。

Q1～Q13代表13个藜麦品种(同表1)，X1～X9代表9个指标(同表6)；热图中红色表示胁迫对指标有促进作用，绿色表示有抑制作用，且颜色越深，作用越强。下同

图2 盐胁迫下13个藜麦品种萌发期各指标热图(左)和聚类分析(右)

图3 碱胁迫下13个藜麦品种萌发期各指标热图(左)和聚类分析(右)

2.3.1 干旱胁迫 由图1-A可以看出，干旱胁迫下13个藜麦品种相对活力指数显示区域均呈现极端绿色，说明干旱胁迫显著降低了活力指数；相对干质量显示区域均呈现红色，说明干旱胁迫增加了干质量。品种Q1、Q6、Q7和Q8整体颜色区域较浅，说明干旱胁迫对这4种藜麦生长的抑制作用较强。干旱胁迫下，根据藜麦各指标变化情况可将13个品种分为4类，品种Q2单独聚为一类，品种Q1、Q8、Q6和Q7聚为一类，品种Q12、Q13、Q9和Q10聚为一类，品种Q3、Q5、Q4和Q11聚为一类。结合主成分分析综合排名结果，通过层状聚类分析将13个藜麦品种分为4大类(图1-B)，品种Q5、Q11和Q12聚为一类，属于高抗旱能力类别；品种Q2、Q4、Q9聚为一类，属于中度抗旱类别；品种Q3、Q13、Q10聚为一类，其某些指标易受干旱胁迫的抑制，属于干旱敏感类别；品种Q7、Q6、Q1和Q8聚为一类，其某些指标受干旱胁迫的抑制程度较为严重，属于高度干旱敏感类别。

2.3.2 盐胁迫 由图2-A可以看出，盐胁迫下13个藜麦品种相对活力指数显示区域均呈现极端绿色，说明盐胁迫显著降低了活力指数，除品种Q7和Q8外，其余品种的相对根长显示区域均呈现绿色。品种Q7和Q8整体颜色区域较其余品种深，说明盐胁迫对这2种藜麦的抑制作用较小。盐胁迫下，根据藜麦各指标变化情况可以将13个品种分为4类，品种Q13、Q4和Q6聚为一类，品种Q12、Q9、Q10、Q2、Q5、Q3、Q1和Q11聚为一类，品种Q7聚为一类，品种Q8聚为一类。结合主成分分析综合排名结果，通过层状聚类分析将13个藜麦品种分为5大类(图2-B)，其中品种Q8和Q7聚为一类，属于高耐盐能力类别；品种Q6、Q2、Q9聚为一类，属于中度耐盐类别；品种Q4、Q10、Q12聚为一类，其某些指标易受盐胁迫的影响，属于盐敏感类别；品种Q3、Q1、Q11和Q13聚为一类，其某些指标受到盐胁迫的抑制程度较为明显，属于高度盐敏感类别，品种Q5单独聚为一类，其某些指标受到盐胁迫的抑制最严重，属于极度盐敏感类别。

2.3.3 碱胁迫 由图3-A可以看出，碱胁迫下13个藜麦品种相对根长显示区域均呈现极端绿色，说明碱胁迫显著抑制了根长的发育。碱胁迫下，根据藜麦各相对指标的变化情况可以将13个品种分为4类，其中品种Q13、Q12、Q2、Q5和Q11聚为一类，品种Q10、Q3、Q4、Q1和Q9聚为一类，品种Q7单独聚为一类，品种Q6和Q8聚为一类。结合主成分分析综合排名结果，通过层状聚类分析可将13个藜麦品种分为3大类(图3-B)，其中品种Q6、Q8和Q7聚为一类，属于高耐碱类别；品种Q1、Q10、Q4、Q9和Q12聚为一类，属于中度耐碱类别；品种Q13、Q2、Q11聚为一类，其某些指标易受碱胁迫的抑制，属于碱敏感类别；品种Q3和Q5为一类，其某些指标受到碱胁迫的抑制程度较严重，属于高度碱敏感类别。

3 讨论与结论

种子萌发期是植物生长发育过程中对逆境最为敏感的时期，关系到植物群体在逆境条件下能否建植成功[19-20]。发芽率、发芽势和发芽指数由种子发芽个数和萌发时间决定，可以反映种子萌发的活力和速率；而活力指数是种子发芽速率和生长量的综合反映[21]。植物从种子发育成幼苗过程中所需的物质及能量由种子中贮藏的有机物提供，因此在种子萌发过程中幼苗长度、鲜质量、干质量等指标能体现植物种苗能量物质的转化状况[22]。本研究发现，不同逆境胁迫对13种藜麦的发芽率、发芽势和发芽指数影响不大，但可以明显抑制其长度伸长，即对活力指数的抑制作用较强，这与对小麦[23-24]、玉米[13,25]、水稻[14,26]、高粱[6,9,16]的研究结果并不相同，Jacobsen等[27]指出，藜麦的抗逆性远高于这些常见作物。可能是由于藜麦种子内可水合的物质含量较高，导致其种皮的渗透势较低，利于其从环境中进行吸水作用。本实验室的前期研究表明，藜麦的萌发速度明显快于小麦、玉米和甜高粱等作物，一般当胚根出现时，即认为是萌发完成；同时在试验中观察发现，盐胁迫藜麦出苗后会出现死苗现象，而在干旱和碱胁迫下这种现象较少出现，这可能是由于藜麦对离子毒害的敏感度高于渗透胁迫。而本研究中盐胁迫的离子含量明显高于干旱和碱胁迫，因此盐胁迫对藜麦种子发芽活力指数的抑制程度高于其余两种胁迫条件。综上所述，藜麦在逆境胁迫条件下能够迅速完成种子萌发的吸胀吸水阶段，从而很快出现萌发完成标志，其发芽数变化不大，但出苗后幼苗生长仍会受到抑制。

由于试验材料或者研究方法的不同，作物抗逆指标的筛选也存在差异。有研究认为，萌发抗旱指数、发芽率、根长可作为高粱萌发期抗旱性的评价指标[9]；也有学者认为，根长、叶质量和发芽率可以作为高粱耐盐性的主要筛选指标[16]，根长、发芽指数、叶干质量可以作为粒用高粱萌发期耐碱性鉴定的指标[28]。本研究选取发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数、芽长、根长、总长、鲜质量和干质量9个指标，通过主成分分析对藜麦萌发期抗旱性进行综合评价，将9个指标归类为2个主成分，其中鲜质量和发芽势分别为2个主成分上的最大载荷，可以作为藜麦萌发期抗旱性的主要鉴定指标；同样，在耐盐性综合评价中，根长、发芽率和干质量是藜麦萌发期耐盐性的主要鉴定指标；而在耐碱性综合评价中，根长、发芽势和鲜质量是藜麦萌发期耐碱性的主要鉴定指标。

利用主成分分析的因子得分函数，可以在综合分析基础上对试验材料的抗逆性进行有效、准确的评定[9]。本研究基于主成分分析的因子得分函数，对每个藜麦品种的抗逆性进行综合评分，结果显示，13个藜麦品种中，陇藜3号、嫁祺2号和钻石1号的抗旱能力较强，HTH-01、南非1号、陇藜4号和HTH-y605属于干旱敏感性品种；HTH-01和HTH-y605属于耐盐性较强品种，陇藜3号的耐盐能力最差；HTH-y605、陇藜4号和HTH-01的耐碱性较强，陇藜3号的耐碱性最差。藜麦萌发期抗旱性与耐盐碱性呈显著负相关，而耐盐性与耐碱性呈极显著正相关，但相关系数不高。这与杨帆等[29]对甜高粱抗旱性与耐盐性相关关系的研究结果不同，说明不同逆境胁迫下植物的抗性关系与物种有关。本研究基于主成分分析的因子得分函数，通过聚类分析进行综合评分分类，从排序和分类结果上看，藜麦萌发期的抗旱性、耐盐性和耐碱性差异与试验过程中的性状表现趋势基本一致，说明采用主成分与聚类分析进行藜麦萌发期抗逆性评价，结果比较可靠。

由于大田中环境变化多样，因此在实验室内进行模拟干旱、盐碱胁迫下的种子萌发试验，从中筛选一批耐性较强的品种，再到大田中进行多年实地验证，可以事半功倍[6]。藜麦萌发期的抗旱性、耐盐性与耐碱性综合评价只是其抗逆性研究的一个方面，仅能说明藜麦萌发期对外界胁迫的响应情况。另外，作物在不同生长发育阶段的抗性表现不同，因此应将种子萌发期抗旱、耐盐碱鉴定结果与其在苗期、灌浆期、开花期、成熟期等全生育期鉴定结果相结合，才能准确鉴定藜麦品种的抗逆性，也才能形成较为完善的藜麦抗逆性评价体系，这将是以后的研究方向。