H9N2禽流感病毒纳米抗体酵母双杂交文库的构建

张 诚，郭承意，周 雷，仝丽娜，文 英，李增魁，张红见，贺晓龙，贾跃宁，康 明，高小龙

(青海大学 农牧学院，青海 西宁 810000)

H9N2亚型禽流感(avian influenza,AI)是目前全世界养禽业流行最广泛的低致病性禽流感,自20世纪60年代从美国火鸡上分离鉴定出H9N2禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)以来，该病毒迅速扩散至世界各地[1-3]。我国于20世纪90年代中期首次从广东省分离到该病毒，之后在全国鸡群中广泛流行[4]。虽然H9N2 AIV致病性较低，鸡群感染后死亡率不到20%，但往往会引起产蛋率严重下降，造成巨大经济损失[5]。同时,H9N2 AIV存在感染人的风险，还可为其他AIV病毒重组提供机会，对公共卫生安全的潜在性威胁不容忽视[6]。因此，加强H9N2 AIV的防控刻不容缓。目前，防控H9N2 AIV的主要措施是接种灭活疫苗，但是由于AIV病毒变异性强，在疫苗免疫的压力下易发生抗原漂移和替换，加上疫苗株和流行毒株不匹配等问题，导致免疫鸡群感染H9N2 AIV的情况时有发生[7-11]。因此，开发新的预防性和治疗性生物制剂很有必要。

纳米抗体(nanobodies,Nbs)是天然存在的具有抗原识别功能的最小的抗体片段，来源于20世纪90年代Hamers等[12]发现的重链抗体(heavy chain antibodies,HCAbs)。重链抗体可变区(variable domain of camelid heavy-chain antibody,VHH)的分子质量仅有15 ku，体积在纳米级，因此也称为Nbs。由于Nbs分子质量小，只有常规抗体的1/10，因此具有许多传统抗体无法比拟的优势，如稳定性强，能耐90 ℃高温和极端pH等环境；亲和力高，与抗原结合的亲和力可达纳摩尔级，甚至皮摩尔级；可识别常规抗体不易识别的结构和表位，如酶的裂隙和其他抗原的凹槽等；适于通过原核或真核表达系统大规模制备，成本低廉，且穿透力强、免疫原性低[13]。因此，Nbs是病毒性疾病诊断和治疗的理想分子，但目前尚未见有关H9N2 AIV Nbs的报道。为此，本研究构建了H9N2 AIV Nbs酵母双杂交文库，并评价了文库质量，以期为后期筛选H9N2 AIV Nbs奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 试 剂 淋巴细胞分离液，购自GE公司；总RNA抽提试剂盒、2 000 DNA Maker和5 000 DNA Marker、2×TaqMix、反转录试剂盒，均购自北京全式金生物技术有限公司；SD/-Leu培养基、YeastmakerTMYeast Transformation试剂盒，购自Clontech公司；DMSO、甘油，购自Sigma公司；琼脂糖，购自TaKaRa公司。其余试剂均为国产分析纯级试剂。

1.1.2 菌株、载体及疫苗 Y187酵母菌、pGADT7-Rec质粒，购自Clontech公司；H9禽流感(F株)灭活疫苗，购自青岛易邦生物工程有限公司；H9亚型AIV阳性血清，购自哈尔滨维科生物技术有限公司；H9N2病毒，由青海大学农牧学院兽医公共卫生实验室保存。

1.1.3 试验动物 H9N2 AIV抗体阴性的6月龄雌性双峰驼1匹，购自甘肃武威。

1.2 动物免疫

将双峰驼保定，臀部肌肉多点注射H9 AIV灭活疫苗15 mL，连续免疫4次，每次间隔2周。第4次免疫后2周，颈静脉采血5～10 mL，分离血清，以H9N2 AIV为4单位抗原(hemagglutination unit,HAU)，用血凝抑制试验(hemagglutination inhibition assay,HI)评价免疫效果，同时设立H9亚型AIV阳性血清、体积分数1%红细胞(red blood cell,RBC)和4 HAU对照。当HI抗体滴度大于1∶24时，采集新鲜抗凝血100～200 mL，用于分离淋巴细胞。

1.3 淋巴细胞分离、总RNA提取及cDNA合成

将新鲜抗凝血与等体积质量分数0.9%的生理盐水轻柔混匀，加入淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，具体操作按试剂说明书进行。分离的淋巴细胞计数后，取约108个淋巴细胞，用RNA提取试剂盒抽提总RNA，测定RNA的质量浓度为590 ng/μL,A260/A280为1.95。取1～3 μg总RNA，以Oligo(dT)为引物，用反转录试剂盒进行反转录，将合成的cDNA保存于-20 ℃备用。

1.4 Nbs基因的巢式PCR扩增

参考GenBank上公布的Nbs基因序列及文献[14]，设计合成F/R、Nano-F/Nano-R和T7/3’AD 3对引物，引物F的序列为：GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG，R的序列为：GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC；Nano-F的序列为：TTCCACCCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGGAGTCT-GGRGGAGG，Nano-R的序列为：GTATCGATGCC-CACCCTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATGGAG-ACGGTGACCWGGGT，其中加粗的斜体部分表示同源臂；T7的序列为：TAATACGACTCACTATAGGG，3’AD的序列为：AGATGGTGCACGATGCACAG。3对引物中，引物F/R用于扩增骆驼体内常规抗体VH-CH1-hinge-CH2区(900 bp)和重链抗体VHH-hinge-CH2区(600 bp)；引物Nano-F/Nano-R用于从VHH-hinge-CH2片段中扩增VHH基因，即Nbs基因(400 bp)；T7/3’AD为通用引物，用于插入片段的鉴定。

以淋巴细胞的cDNA为模板，以F和R为引物，PCR扩增重链抗体VHH-hinge-CH2区，并设立灭菌水为阴性对照。PCR反应体系(50 μL)为：F和R引物各1 μL，2×TaqMix 25 μL，cDNA 2 μL，灭菌水补足50 μL；PCR反应程序为：95 ℃预变性5 min；95 ℃ 40 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 50 s，35个循环；72 ℃ 10 min。用1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，预期出现900和600 bp 2条条带，切胶回收600 bp的目的条带。

以600 bp的胶回收产物为模板，以Nano-F和Nano-R为引物，PCR扩增Nbs基因，并设立灭菌水为阴性对照。PCR反应体系(50 μL)为：Nano-F和Nano-R引物各1 μL，2×TaqMix 25 μL，600 bp的胶回收产物3 μL，灭菌水补足50 μL。PCR反应程序为：95 ℃预变性5 min；95 ℃ 30 s，67 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃ 10 min。用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，切胶回收400 bp的目的条带，即为Nbs基因。根据Clontech公司Mate & PlateTMLibrary System说明书，用醋酸钠乙醇沉淀法浓缩胶回收Nbs基因，并用NanoDrop微量分光光度计测定浓缩后的DNA质量浓度，使其达到0.1～0.25 μg/μL。

1.5 AIV Nbs酵母双杂交文库的构建

将浓缩的20 μL(4.2 μg)Nbs基因与6 μL pGADT7-Rec共转Y187酵母感受态细胞，详细步骤参见YeastmakerTMYeast Transformation System 2说明书。转化产物涂布约90个直径150 mm的SD/-Leu平板，30 ℃倒置培养3～5 d；所有平板置于4 ℃冰箱预冷约4 h后，给每个平板加4 mL含体积分数25%甘油的YPDA培养基，用涂菌棒缓慢地从培养基上刮下所有菌落，混合至锥形瓶中摇匀，分装至1.5 mL EP管中，于-80 ℃保存备用，即得AIV Nbs酵母双杂交文库。

根据酵母双杂交文库构建说明书，分别取转化产物和最终构建的文库适量，10倍倍比稀释后涂布SD/-Leu平板，30 ℃倒置培养3～5 d，统计各稀释度平板上的菌落数，估算文库库容和滴度。

从上述SD/-Leu平板上长出的克隆中，用灭菌枪头随机挑取23个直径约3 mm的菌落，涂抹于1.5 mL EP管管壁，于微波炉中高火加热50 s，-20 ℃冷冻4 min，重复5次，加15 μL灭菌水制备菌落PCR模板。以3’AD和T7为引物进行菌落PCR鉴定，并设立灭菌水为阴性对照。PCR反应体系(50 μL)为：3’AD和T7引物各1 μL，2×TaqMix 25 μL，模板2 μL，灭菌水补足50 μL。PCR反应程序为：95 ℃预变性5 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，评价文库菌重组效率。最后随机挑取10个阳性PCR产物，送生工生物(上海)工程股份有限公司测序，分析文库序列特征是否符合Nbs序列特点以及多样性。

2 结果与分析

2.1 H9 AIV灭活疫苗的免疫效果

双峰驼经H9亚型禽流感(F株)灭活疫苗连续免疫4次后，HI试验测得血清抗体滴度为1∶29(图1)，达到预期免疫效果要求，可用于后续试验。

2.2 Nbs基因片段的扩增

以制备的淋巴细胞cDNA为模板，用F和R为引物进行第一次PCR扩增，PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果显示成功扩增出大小分别为900 和600 bp的2条条带(图2)，切胶回收600 bp的条带备用。

以回收的600 bp条带产物为模板，用Nano-F和Nano-R引物进行第二次PCR扩增反应，产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后切胶回收，结果(图3)显示成功扩增出400 bp的Nbs基因片段。

4HAU.4单位抗原对照；RBC.1%红细胞对照

M.2 000 DNA分子量标准；1～8.PCR产物；9.阴性对照

M.5 000 DNA分子量标准；1～14.Nbs基因；15.阴性对照

利用醋酸钠乙醇沉淀法浓缩胶回收Nbs基因后，经测定，其质量浓度为0.21 μg/μL，共计30 μL，满足文库构建要求。

2.3 AIV Nbs酵母双杂交文库的质量评价

取浓缩的Nbs基因与pGADT7-Rec质粒共转Y187酵母感受态细胞，构建AIV Nbs酵母双杂交文库，经检测，文库库容为2.4×108，文库滴度为4.2×109CFU/mL。

收获文库时从SD/-Leu平板上随机挑取23个克隆，用3’AD和T7通用引物进行菌落PCR鉴定，结果如图4所示。图4显示，23个克隆中有22个含Nbs基因，插入重组效率为95.6%。

M.2 000 DNA分子量标准；1～23.随机挑取的23个克隆；24.阴性对照

从上述PCR产物中随机挑取10个阳性条带，胶回收后测序。根据测序结果，对推导氨基酸序列进行比对分析，结果如图5所示。图5显示，在骨架1区(Framework region 1,FR1)和FR3区存在特征性半胱氨酸，可形成额外的二硫键。同时，在FR2区37位(Val→Phe/Tyr)、44位(Gly→Glu/Gln)、45位(Leu→Arg)和47位(Trp→Gly/Phe/Leu)发生了疏水性氨基酸向亲水性氨基酸的替换，且10个序列各不相同，均为独立克隆。

推导氨基酸序列根据Kabat编号进行比对分析;1～10为随机挑取的10个克隆;灰色标记的为差异性氨基酸；“-”表示氨基酸缺失；实线框标记的为Nbs序列中2个特征性半胱氨酸；虚线框标记的为Nbs序列FR2区中的4个特征性氨基酸残基

3 讨 论

疫苗免疫是H9N2 AIV防控的主要措施，但是由于AIV病毒抗原变异性强，免疫鸡群感染H9N2 AIV仍时有发生，且H9亚型存在感染人的风险[6-11]，因此，探究H9N2 AIV抗原变异的分子机制、鉴定保守表位、开发广谱疫苗和治疗性制剂迫在眉睫。与常规单克隆抗体相比，Nbs在揭示新的抗原表位、感染性疾病诊断和治疗上具有明显优势。Gong等[15]筛选了H7N2的Nbs，并建立了基于Nbs的H7N2 AIV快速检测方法。Ibanez等[16]筛选了具有体外中和活性的H5N1 AIV Nbs。Gao等[17]通过酵母双杂交筛选了新城疫病毒HN蛋白的Nbs。2019年2月，FDA正式批准了赛诺菲旗下用于治疗获得性血栓性血小板减少性紫癜的Nbs Caplacizumab，成为全球上市的第一个Nbs药物。

抗体文库大体可分为两类，一种是免疫文库，另一种是非免疫文库。在非免疫文库构建中，由于抗体基因来自天然(未经主动免疫)的动物免疫细胞，因此抗体序列信息能反映动物本身抗体序列的多样性特点，理论上可以筛选任何抗原的抗体[18]。而免疫文库中的抗体基因来自经特定抗原刺激的免疫细胞，其靶向特定抗原的抗体序列得到富集，可筛选出种类更多、亲和力更强的抗体[19]。免疫效果的好坏是构建高质量免疫抗体文库的重要前提。本研究中，为获得较好免疫效果，根据双峰驼与鸡体质量的比例最终确定疫苗接种剂量为15 mL，且首免后又进行了3次加强免疫，使最终HI抗体滴度可达1∶29，为构建高质量酵母双杂交抗体文库提供了保证。

抗体文库构建中，抗体片段与载体的克隆大多采用传统的酶切连接方法，为克服酶切连接效率低、过程繁琐且易受酶切位点限制等不足，本研究根据pGADT7-Rec载体序列，在Nbs扩增引物两端添加了同源臂，扩增的Nbs基因片段与pGADT7-Rec共转Y187感受态后，通过同源重组可直接完成克隆，过程简单快捷[14]。经鉴定，文库的插入重组效率可达95.6%。

相对常规抗体重链可变区而言，Nbs序列有其显著特征。首先，在FR2区37位(Val→Phe/Tyr)、44位(Gly→Glu/Gln)、45位(Leu→Arg)和47位(Trp→Gly/Phe/Leu)存在疏水性氨基酸向亲水性氨基酸的转换，增加了FR2区的亲水性，弥补了轻链缺失导致的缺点，改善了Nbs的稳定性、可溶性、易聚集性。本研究构建的Nbs文库序列在FR2区均存在上述位点的氨基酸替换，与先前的报道[13]一致。其次，Nbs拥有较长的CDR3区，平均为16～18个氨基酸，但也有部分Nbs的CDR3区较短。本研究随机挑取的10个Nbs中，有4个CDR3区由16个氨基酸构成，有1个CDR3区由3个氨基酸构成，与Vu等[20]的报道相符合。较长的CDR3区不仅可增加Nbs的稳定性和可溶性，也有助于识别一些常规抗体不易识别的抗原位点，如酶的裂隙和其他抗原的凹陷部位等。

文库库容和多样性直接影响到后期能否筛选到高质量的抗体。对于免疫文库而言，由于建库时动物经过抗原免疫，使针对特定免疫原的B细胞得到了很好地富集，因此抗体库库容一般达到106，甚至105即可。本研究中，文库库容为2.4×108，文库插入重组率为95.6%,且均为独立克隆，表明构建的文库库容和多样性良好，为下一步筛选H9N2 AIV Nbs奠定了基础。