黑果枸杞基因组SSR标记开发及遗传多样性分析

黄兴发，尹 跃，，赵建华，姚佳依，秦小雅，汪淑芬，曹有龙，战祥强

(1西北农林科技大学 园艺学院，陕西 杨凌 712100；2宁夏农林科学院 国家枸杞工程技术研究中心，宁夏 银川 750002)

黑果枸杞(LyciumruthenicumMurr.)系茄科(Solanaceae)枸杞属(Lycium)多年生落叶多棘刺灌木植物，主根系发达，具有较强的抗旱性和耐盐性[1-2]，主要分布在我国新疆、青海、甘肃、宁夏等西北地区盐碱地、沙漠、路边等，是西北地区水土保持的先锋树种[3],其果实富含丰富的花青素和多酚物质，具有抗氧化、抗衰老等功效[4-8]，已成为当前国内外研究的热点领域。近年来，国家枸杞工程技术研究中心收集保存了黑果枸杞种质资源，但这些资源遗传背景复杂，限制了黑果枸杞的品种选育和产业发展。因此，加强黑果枸杞种质资源遗传多样性分析及遗传图谱构建等研究，对黑果枸杞新品种选育及产业发展具有重要意义。

简单重复序列(simple sequence repeats，SSR)又称为短串联重复(short tandem repeats，STR)或微卫星DNA(microsatellite DNA)，广泛存在于真核基因组中。SSR标记因具有共显性、多态性高、高通量数据易处理及易共享等优点[9]，已广泛应用于山茶、白蜡等植物遗传多样性评价、核心种质和遗传图谱构建及重要性状定位等研究领域[10-15]。近年来，随着高通量测序技术和生物信息学技术的快速发展，大规模植物已完成全基因组测序[16]，人们基于全基因组测序数据开发了大量的SSR标记，且建立了SSR标记检索数据库[17-19]，为SSR标记的利用提供了快捷的途径。而枸杞SSR标记开发及应用的研究相对滞后，目前已从红果枸杞中开发了一批多态性高的SSR标记，并应用于品种鉴定、分子指纹图谱构建及遗传多样性评价研究[20-26]。然而，由于物种间的扩增效率不一样，基于红果枸杞开发的SSR引物在黑果枸杞属植物扩增效率较低，难以满足黑果枸杞遗传多样性分析及遗传图谱构建等研究的需要。

基于此，本研究以2年生的黑果枸杞幼嫩叶片为材料，基于Illumina Hiseq 2500测序平台，采用MISA软件对测序组装黑果枸杞基因组进行扫描，设计开发并筛选出一批黑果枸杞SSR标记，旨在用于黑果枸杞种质资源遗传多样性评价及遗传图谱构建等方面，为黑果枸杞新品种选育及产业发展奠定基础。

【注意事项】1.眼部、外阴等皮肤黏膜及破损处禁用。2.本品为外用药，不可内服。3.涂布部位如有明显灼热感或瘙痒、局部红肿等情况应停止用药，洗净，必要时向医师咨询。4.对本品过敏者禁用，过敏体质者慎用。5.药品性状发生改变时禁止使用。6.儿童必须在成人的监护下使用。7.请将本品放在儿童不能接触的地方。8.如正在使用其他药品，使用本品前咨询医师或药师。

1 材料与方法

1.1 试验材料

高通量测序所用材料为2年生的黑果枸杞Lr-01无性系(图1)，表现为刺多，花量大，具有较强抗旱性和耐盐性；引物筛选和多态性验证的材料为18份宁夏枸杞、1份中国枸杞、23份黑果枸杞和6份其他枸杞种质(表1)，以上材料均定植于宁夏农林科学院枸杞种质资源圃(38°38′49″N，106°09′10″E)。2018年5月采集幼嫩健康叶片用于基因组DNA提取。

A.整株 Whole plant；B.花 Flower；C.果实 Fruit

表1 供试枸杞材料

1.2 试验方法

1.2.1 基因组DNA提取 采用试剂盒法(DP305，天根)从枸杞幼嫩叶片中提取基因组DNA，用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量完整性，紫外分光光度计(Eppendorf，Bio Photometer plus)检测DNA浓度和纯度，将DNA质量浓度稀释至50 ng/μL，置于-20 ℃保存，用于后续PCR试验。

1.2.2 高通量测序与组装分析 对质检合格基因组DNA进行文库构建，由北京百迈客生物科技有限公司利用Illumina Hiseq 2500测序平台对DNA文库进行PE150测序。测序完成后，过滤掉接头污染、低质量和含N比列大于5%的Reads。利用SOAP denovo软件[27]进行序列拼接和组装。

1.2.3 SSR位点鉴别与引物设计 使用MISA软件(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)进行SSR位点的搜索，搜索的标准为：重复基元长度1～6 bp，单核苷酸重复基序的最小重复数为10；二核苷酸重复基序的最小重复数为6；三、四、五和六核苷酸重复基序的最小重复数均为5。两个SSR序列间隔最小值为100 bp，即序列间隔。

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由图4可以看出，当k=2时，ΔK值最大，依据Evanno[34]提出的ΔK值分析方法，48份供试枸杞种质可划分为2个类群。

1.2.4 PCR扩增及多态性SSR引物筛选 PCR扩增体系15 μL：50 ng/μL DNA模板1 μL，10×Buffer 1.5 μL，10 μmol/L dNTP 1.2 μL，5 μmol/L上游引物1 μL，5 μmol/L下游引物0.2 μL，5 μmol/L M13荧光引物0.8 μL，TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.1 μL，灭菌后去离子水9.2 μL。

PCR反应在Gene Amp PCR System 9600(Perkin Elmer，USA)仪上进行，扩增程序为:94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，25个循环；94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，10个循环；最后60 ℃ 30 min。扩增产物经过ABI3730XL DNA(Applied Biosystems，USA)检测，采用LIZ-500作为分子量内标。

1.3 数据统计与分析

用GeneMapper 4.0软件对ABI3730XL收集的原始数据进行分析，获得不同样品扩增片段的长度；采用DataFormater软件[29]将扩增片段转化为PowerMarker v3.25、NTSYS-pc2.20和STRUCTURE2.3.4输入格式。由PowerMarker v3.25软件[30]计算等位基因数(number of alleles,Na)、观察杂合度(observed heterozygosity,Ho)、期望杂合度(expected heterozygosity,He)、多态信息含量(polymorphism information content,PIC)遗传多样性参数。用NTSYS-pc2.20软件[31]计算种质间的遗传距离，然后将遗传距离矩阵导入MEGA 6.06软件，采用UPGMA法进行聚类分析，绘制系统聚类树,并用在线软件iTOL(https://itol.embl.de/itol.cgi)编辑美化。用STRUCTURE2.3.4软件[32]对48份枸杞材料进行群体结构分析，设置群体数k值为1～10，每个参数运行10次，每次运行的burn-in time设置为10 000，重复次数为100 000，得到ΔK值，绘制k与ΔK的关系图。用STRUCTURE HARVESTER在线软件[33]对群体种质资源遗传结构进行可视化分析，用个体归属各组群的比例(Q值)与群体数(k)来研究供试枸杞种质间是否存在基因交流。

2 结果与分析

2.1 黑果枸杞基因组中SSR位点数及分布频率

根据多态性结果，从37对SSR引物中挑选出10对，分析其在48份材料中的遗传参数，结果(表4)发现，共检测到186个等位基因，最少12个，最多28个，平均19个；观察杂合度为0.375～0.854，平均为0.615；期望杂合度为0.730～0.922，平均0.834；多态信息含量为0.692～0.917，平均0.817。表明供试枸杞种质间具有丰富的遗传多样性。

在黑果枸杞基因组SSR位点中，以10次重复次数最多，达804个SSR位点，占总SSR位点数的32.24%；其次为6和11次重复，SSR位点数分别为389和282，占总SSR位点数的15.59%和11.30%(表2)。

表2 黑果枸杞基因组中1～6 bp核苷酸重复单元基序的SSR数量

2.2 黑果枸杞基因组中SSR基序类型和频率

从黑果枸杞基因组SSR基序类型(表3)来看，2 494个SSR位点中共有21种重复基序，单核苷酸至六核苷酸重复基序类型依次有2，3，7，2，5和2种。

表3 黑果枸杞基因组SSR基序类型的分布

利用NTSYS-pc2.20软件计算48份枸杞种质间的遗传距离，然后用UPGMA法绘制系统聚类树(图3)。

2.3 枸杞基因组中多态性SSR引物的筛选

以表型差异较大的4份种质‘宁杞1号’、‘Lc-01’、‘天精5号’和‘Lr-01’为材料，对设计合成的150对SSR荧光引物进行多态性引物筛选，其中37对引物表现出高的多态性，多态性比率为24.6%。以引物LRSSR0018为例，其在4份种质上扩增荧光毛细管电泳图见图2。由图2可知，引物LRSSR0018在4份种质间表现出高多态性。

宝清县地下水可开采量25 612.13万m3/a，目前地下水开采量24 173.39万m3/a。地下水开发利用程度较高，为94%。宝清县地下水开发利用程度高主要受宝清镇、五九七农场、八五三农场井灌水田区的影响。宝清镇地下水开发利用程度为161%，五九七农场地下水开发利用程度为140%，八五三农场井灌水田区地下水开发利用程度320%，除此以外宝清县朝阳乡地下水开发利用程度81%，其余乡镇地下水开发利用程度低于65%，尚有开发利用空间。

不同加工方法牡丹皮中7种指标性成分的含量测定及质量评价 …………………………………………… 张洪坤等（22）：3063

图2 引物LRSSR0018在4份枸杞材料中的毛细管电泳检测结果

2.4 枸杞基因组中SSR标记遗传多样性分析

利用MISA软件对组装获得2G数据量72 852条Scaffolds(序列总长为13 187 545 bp)进行查找分析，发现含有符合条件的SSR Scaffolds有2 326条，发生频率为3.19%。共查到2 494个SSR位点，分布频率为3.42%，其中每5.29 kb就具有1个SSR位点。黑果枸杞基因组中SSR类型丰富，单核苷酸至六核苷酸重复类型均存在。其中，单核苷酸重复类型数量最多，为1 476个，占总SSR位点数的59.18%；其次为二核苷酸和三核苷酸重复类型，分别为676和293个，占总SSR位点数的27.11%和11.75%；四、五、六核苷酸重复类型的数量很少，总共仅占总SSR位点数的1.96%。由此可见，黑果枸杞基因组SSR重复基元的数量随着碱基重复次数的增加呈降低趋势(表2)。

表4 10个SSR标记在48份枸杞材料中的遗传参数

2.5 48份枸杞种质间的系统聚类分析

单核苷酸中基序类型以A/T为主，占总SSR位点类型的56.05%。二核苷酸重复基序类型有3种，即AC/GT、AG/CT和AT/AT，其中AT/AT基序所占的比例最高，为12.35%。三核苷酸重复基序类型有7种，其中AAC/GTT重复基序类型最多有133个(5.33%)，ACC/GGT重复基序类型最少有4个(0.16%)。四核苷酸重复基序类型以AAAG/CTTT(6个，0.24%)和ACAT/ATGT(6个，0.24%)为主。五核苷酸重复基序类型以AATTC/AATTG(12个，0.48%)和ATATC/ATATG(12个，0.48%)为主。六核苷酸重复基序类型以ACTGCT/AGCAGT(8个，0.32%)为主(表3)。

图3 基于UPGMA法构建的48份枸杞种质的系统聚类树

由图3可知，48份枸杞种质被划分为Ⅰ和Ⅱ 2个类群。类型Ⅰ中含有23份种质，全部是黑果枸杞。类型Ⅱ中包括25份种质，大部分为宁夏枸杞，其中宁杞5号与宁杞10号、蒙杞1号与蒙杞2号、宁杞菜1号与宁杞9号亲缘关系最近，这与其来源及遗传背景相符合；5份黄果枸杞聚为一小分枝，果实颜色均为黄色，果形为近球形。天精3号和天精5号亲缘关系较近，与其他种质亲缘关系较远，这2份种质为软枝型，生长势强，叶片肥大。本研究分类结果与形态聚类结果相一致。

2.6 48份枸杞种质的群体结构分析

对于实施分层管理模式前后患者的满意度、护理人员自身的满意度、医生对于护士的满意度、护理部门质控检查的平均成绩等进行调查和比较,前后存在有明显的差异性,P<0.05,差异具有统计学意义。详细情况请参见表1所示。

运用Primer 3.0软件[28]进行引物批量设计。随机选择150对引物按照以下参数设计：引物长度18～27 bp，GC含量在40%～60%，退火温度50～60 ℃，上、下游引物的退火温度相差不超过5 ℃。在上游引物5′端添加18 bp的M13通用引物序列(TGTAAAACGACGGCCAGT)，3′端保持不变，FAM和HEX两种荧光基团修饰通用引物，所有引物均由英潍捷基贸易有限公司合成。

采用STRUCTURE HARVESER在线软件分析后，将48供试枸杞种质分成2个不同的群体结构，不同颜色表示不同的类群，分别用S1(白色)和S2(灰色)表示(图5)。

由图5可知，S1类群包括25份种质，含有23份黑果枸杞、天精3号和天精5号，占类群总数的52%。多数种质的Q值大于0.95(除了18号种质(中科绿川1号))，表明种质来源单一，与其他种质基本无基因交流。18号种质(中科绿川1号)虽隶属宁夏枸杞，但因其含有40.8%的S2遗传背景，因此本研究将其划分在S2类群中。

式中：cF为折减后的总黏聚力；φF为折减后的内摩擦角；kF为折减后的DP5总黏聚力；αF为折减后的DP5内摩擦角；Ftrial为折减系数。

由图5还可知，S2类群包括23份种质，含有18份宁夏枸杞、1份中国枸杞和4份其他种质，占类群总数的48%。其中11号和19号2份种质分别含有39.7%和46.5%的S1遗传背景，而11号为三倍体菜用枸杞宁杞菜1号，生长势强，发枝量大；19号为中国枸杞Lc-01，果实形状与黑果枸杞属植物相近，为圆形果实，适应性强，在全国广泛分布。

图4 48份枸杞种质资源中群体数(k)与ΔK关系

图5 48份枸杞种质资源遗传结构

3 讨 论

本研究利用Illumina Hiseq 2500测序平台对黑果枸杞无性系Lr-01基因组进行PE150测序，获得总数据量为2G；利用MISA软件共检索到2 494个SSR位点，平均每5.29 kb就出现1个SSR位点，与红果枸杞[24]及茄科其他植物，如茄子[35]、辣椒[36]、马铃薯[37]和烟草[38]等植物相比，SSR位点出现频率较低，这可能与本研究测序数据量大小及检索标准有关[38]。

本研究中，黑果枸杞基因组中优势重复单元类型为单核苷酸(59.18%)、二核苷酸(27.11%)和三核苷酸(11.75%)，而四、五和六核苷酸总计占1.96%。在重复单元类型中，以A/T、AC/GT、AT/AT和AAC/GTT出现频率最高，说明黑果枸杞基因组SSR序列中富含有A和T碱基。这与红果枸杞、枣等植物中SSR基序分布规律一致[24,39]。

目前，基于高通量测序技术已广泛应用于SSR标记开发，而SSR标记最广泛应用是种质资源遗传多样性分析[9,12,40]。本研究从2 494个SSR位点中设计开发出150对SSR引物，最终挑选出10对多态性高的SSR引物应用于48份枸杞种质遗传多样性分析，共检测到186个等位基因，多态信息含量(PIC)均大于0.5，属于高度多态性SSR引物[41]。本研究用筛选出的10对SSR引物对48份种质聚类分析结果与遗传结构分析结果相一致，与基于红果枸杞开发SSR标记[23,26]及SCoT[42]和SRAP标记[43]研究结果相一致。说明筛选出的10对SSR引物质量较高，并且在物种间转移扩增效率较高。

本研究基于高通量测序技术和生物信息分析，开发了黑果枸杞基因组SSR标记，统计分析黑果枸杞基因组SSR数量、长度、频率等特征，设计开发了一批SSR引物，丰富了黑果枸杞分子标记类型。但由于测序数据量小，开发及筛选出具有多态性SSR标记较少。因此，今后研究需要加测数据量，筛选出大量具有多态性的SSR标记，且建立黑果枸杞SSR标记检索数据库，既为黑果枸杞遗传多样性和遗传结构分析提供SSR标记支撑，也为黑果枸杞种质资源开发利用提供理论依据，对推动黑果枸杞新品种选育及产业发展具有重要意义。