丙泊酚对七氟烷引起的大鼠海马神经细胞凋亡及认知障碍的影响及相关机制探究

肖秀英，吴华兵，詹玮玮

大脑海马是大脑中枢神经系统中最复杂的部位[1]。海马神经元主要由海马神经细胞构成，当海马神经细胞受损后会引起记忆功能减退、学习能力降低、认知发生障碍等症状[2]。随着现代医疗技术的发展，麻醉在各种手术中扮演着重要角色，其中七氟烷是目前临床上使用较为广泛的吸入类麻醉剂[3]。既往研究显示，七氟烷对中枢神经系统的发育、学习和记忆功能都有潜在损伤，吸入量过多会严重影响海马神经细胞并导致其凋亡[4]。丙泊酚是一种临床常用的静脉麻醉药，多用于肿瘤切除手术的麻醉[5]。丙泊酚可以减轻七氟烷带来的应激反应；同时可以通过调节核因子-κB(NF-κB)通路和炎症反应因子活性，对心脑血管起到保护作用[6]。目前有关丙泊酚治疗七氟烷引起大鼠海马神经细胞损伤及认知障碍的相关机制尚不完全统一。本文旨在探究丙泊酚对七氟烷引起大鼠海马神经细胞损伤及认知障碍的相关机制。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组 SPF级雄性SD大鼠60只，3周龄，体重(200±15)g，均由广东医学院实验动物中心提供，实验动物许可证号：粤监证字2004A029号。本实验遵循动物实验3-R原则同时已获得动物伦理委员会批准。适应性喂养1 周，随机分为对照组、七氟烷组、联合组，每组20只。

1.2实验药物与试剂 丙泊酚注射液(四川国瑞药业有限责任公司，国药准字H20030115)；Bax、Bcl-2、Caspase-3抗体均购自Santa Cruze Biotechnology 公司；HRP羊抗兔IgG、HRP羊抗鼠IgG等二抗购自美国Thermo公司；Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒购自四季青公司；白介素-6(interleukin-6, IL-6)、IL-1β、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)试剂盒子购自美国Sigma公司。

1.3实验仪器 生化分析仪(型号：Sysmex-chemix-180)购自日本Furuno Electric公司；电子天平(型号：BS-124s)购自北京赛多斯仪器系统有限公司；正置型金相显微镜(型号：SG-51)购自上海光学仪器厂；蛋白电泳及转膜仪购自Bio-Rad公司；凝胶成像系统购于以色列DNR公司；LD-66实验室切片机购自长沙益广制药机械公司。流式细胞仪(型号：CytoFLEX)购自美国Beckman公司。

1.4药物干预方法 七氟烷组每天吸入1.5%七氟烷1 h；联合组在七氟烷组基础上加用丙泊酚注射液150 mg/kg；对照组给予等量生理盐水。3组均给药14 d。

1.5观察指标

1.5.1大鼠神经功能检测：3组均于药物干预24 h后，分别使用Y-迷宫实验及Longa评分法评价大鼠神经功能[7]。①Y-迷宫实验：在Y-迷宫中控制仪释放电击电压为70 V、延迟2 s的电刺激来电击大鼠足部。控制仪中的反射箱顶端有3有个信号灯，根据灯光信号电击大鼠，让大鼠逃离至安全区域。记录各组错误反应次数和逃离时间。②Longa评分法：评分为5个等级，0分为正常，大鼠无神经功能缺损；1分为大鼠左侧前爪不能完全伸展；2分为大鼠行走时向左侧旋转；3分为大鼠行走时向左侧倾；4分为大鼠不能自发行走。评分越高提示大鼠神经功能缺损越严重。

1.5.2蛋白免疫印迹法检测相关蛋白表达水平：3组完成神经功能检测后，将大鼠使用断脖法处死，取其大脑海马区组织，剪碎后用胰蛋白酶消化，提取总蛋白并转移到PVDF膜，常规封闭2 h后加入各需要检测蛋白的一抗、二抗，并孵育，本研究使用的内参蛋白为β-actin，采用显色液显色后行吸光度分析，计算各蛋白相对表达量。

1.5.3细胞凋亡检测：取3组大鼠的海马区组织，使用胰蛋白酶消化为单层细胞离心，4℃、离心5 min；收集细胞后加入Binding Buffer重悬细胞100 μl、Annexin V-FITC 5 μl、PI 5 μl，避光孵育后加入Binding Buffer；采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.5.4血清炎性因子检测：断脖法处死大鼠后，取其血液离心，1500 r/min、离心15 min，取去上清液后的沉淀，按照试剂盒操作方法检测IL-6、TNF-α、IL-1β含量。

2 结果

2.1大鼠神经功能比较 与对照组相比，七氟烷组逃离时间、错误反应次数和Longa评分显著升高(P<0.05)。与七氟烷组相比，联合组逃离时间、错误反应次数和神经功能评分显著降低(P<0.05)。见表1。

表1 3组大鼠神经功能检测比较

2.2大鼠海马区细胞凋亡情况比较 3组海马区细胞凋亡率分别为：对照组(7.58±0.29)%、七氟烷组(31.69±2.35)%、联合组(15.21±1.03)%。与对照组相比，七氟烷组细胞凋亡率显著升高(P<0.05)；与七氟烷组相比，联合组细胞凋亡率显著降低(P<0.05)。见图1。

图1 3组大鼠海马区细胞凋亡情况比较

2.3大鼠海马区凋亡蛋白表达比较 与对照组相比，七氟烷组Bax蛋白和Caspase-3蛋白相对表达水平显著升高，Bcl-2蛋白相对表达水平显著降低(P<0.05)。与七氟烷组相比，联合组Bax蛋白和Caspase-3蛋白相对表达水平显著降低，Bcl-2蛋白相对表达水平显著升高(P<0.05)。见图2、表2。

图2 3组大鼠海马区Bax、Caspase-3、Bcl-2蛋白表达情况

表2 3组大鼠Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白相对表达量比较

2.4大鼠血清炎性因子比较 与对照组比较，七氟烷组血清IL-6、IL-1β和TNF-α含量显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与七氟烷组比较，联合组大鼠血清IL-6、IL-1β和TNF-α含量显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 3组大鼠IL-6、IL-1β和TNF-α含量比较

3 讨论

吸入七氟烷与记忆损伤程度密切相关，吸入七氟烷会对海马CA1区锥体神经元电压门控通道有影响[8]；也会在脑发育过程中对海马CA1 区锥体神经元电压门控通道产生抑制作用，找到减少七氟烷麻醉带来的认知功能障碍和海马神经细胞凋亡一直是麻醉学研究的难点和热点。丙泊酚作为一种静脉全身麻醉药被广泛应用，其脑保护作用也有较多研究[9-10]。本研究结果显示，与七氟烷组相比，联合组大鼠逃离时间、错误反应次数和Longa评分显著降低，说明对于七氟烷引起大鼠海马神经细胞损伤模型，丙泊酚可使大鼠神经功能和记忆功能得到有效改善。与王洁和王建华[11]报道的丙泊酚麻醉可有效降低患者术后认知障碍发生率的结论一致。

海马神经细胞凋亡是引起大鼠神经功能受损的重要因素之一[12]，而细胞凋亡受各种基因调控。目前研究较多的基因包括Caspase家族和Bcl-2家族基因，Caspase家族中Caspase-3和caspase-9等是Caspase最常见的凋亡因子[13]。Caspase-9主要作用是通过自身裂解使得proCaspase-3 产生有活性的Caspase-3，引起细胞凋亡的级联反应，最终导致细胞凋亡。除了Caspase家族蛋白可以调控细胞凋亡外，Bcl-2家族的Bcl-2蛋白和Bax蛋白也可以调控细胞的凋亡[14-15]。本研究结果显示，与七氟烷组相比，联合组大鼠海马区细胞凋亡率显著降低；说明丙泊可以明显降低海马区细胞的凋亡水平。本研究结果同时显示，与七氟烷组相比，联合组Bax蛋白和Caspase-3蛋白相对表达水平显著降低，Bcl-2蛋白相对表达水平显著升高。说明丙泊酚可以升高抑制凋亡蛋白的表达水平，抑制海马细胞凋亡，从而使大鼠的神经功能得到显著的改善。与胡洪凭等[16]报道的丙泊酚通过激活相关信号通路抑制神经细胞凋亡结论一致。

大鼠海马组织受到损伤后会引发炎症反应，可使Th1细胞分泌促炎性细胞因子，主要为TNF-α、IL-1β、IL-6 和IL-8等[17-18]。本研究结果显示，与七氟烷组相比，联合组大鼠血清IL-6、IL-1β和TNF-α水平显著降低。这可能与丙泊酚可使NF-κB和NLRP3炎性体激活，抑制炎症反应，从而保护大鼠海马区细胞有关；与于文娟等[19]报道一致，该研究认为丙泊酚可抑制炎症反应，影响大鼠认知功能。

综上所述，丙泊酚可以缓解七氟烷引起大鼠海马神经细胞损伤，其作用机制与抑制海马细胞凋亡和炎症反应相关。