运动训练对轻度认知功能障碍模型小鼠学习记忆能力减退及海马组织病理学改变的影响

方 侃，吕光辉，汪新体，艾志兵，王启斌

随着我国人口老龄化进程的加剧，阿尔茨海默病(alzheimer's disease, AD)已成为严重危害中老年人心身健康的公共卫生问题；其发病机制不明，亦无有效治疗药物。轻度认知功能障碍(mild cognitive impairment, MCI)是介于正常衰老和痴呆之间的一种不稳定的临床状态；其既有认知功能的可逆性，又可以逐渐加重并最终发展为AD。65岁以上MCI患者AD的发病率为10%～15%。因此，正确认识和有效干预MCI对早期防治AD具有重要意义[1-5]。目前在MCI动物模型的研究中存在3个问题[6-9]：一是完全沿袭AD的造模过程，以至于不能准确把握MCI的病理生理阶段；二是制模因素单一、过程偏短，只是在一个点或一个局部表达MCI的急性病理变化；三是认知功能障碍的可逆性无法验证。因此，必须尝试建立具有临床MCI特征的动物模型以探索该病的病因、发病机制及有效干预措施。衡量MCI动物模型的是表面效度(类似人MCI行为表现)、结构效度(类似人MCI病理学改变)及预测效度(模型行为学改变可逆转)。有氧运动可以通过多种机制有效减缓痴呆患者的认知障碍速度[10-13]。本研究采用D-半乳糖(D-galactose, D-gal)、三氯化铝和亚硝酸钠联合作用构建MCI小鼠模型，观察了运动训练对MCI模型小鼠学习记忆能力减退及海马组织病理学改变的影响。

1 材料与方法

1.1实验动物 选取雄性昆明小鼠90只，16月龄，体重50～55 g，SPF级，由湖北医药学院实验动物中心提供，实验动物合格证号[SYXK(鄂)2016-0031]，生产许可证号：SCXK(鄂)2016-0008。适应性喂养1周，自由饮食，光照12 h/d，室温(22±2)℃，湿度(50～60)%。本项目经学医院医学伦理委员审查批准。

1.2主要实验仪器及试剂 SA101小动物跑台(江苏赛昂斯公司)；MT-200水迷宫行为学跟踪系统(成都泰盟公司)；D-gal(美国Amresco公司)；胆碱乙酰转移酶(choline acetyltransferase, ChAT)、乙酰胆碱酯酶(acetylcholine esterase, AchE)、β-淀粉样蛋白42(amyloid beta 42, Aβ42)、酶联免疫吸附实验(ELISA)试剂盒均购自美国elabscience公司，改良Bielschowsky神经染色液(武汉卡诺斯公司)，热电Multiskan MK3全自动酶标仪(美国)。

1.3实验方法

1.3.1动物分组及MCI小鼠模型复制：将90只小鼠按数字表法随机分为对照组、MCI模型组、运动干预组，每组30只。MCI模型组、运动干预组小鼠给予100 g/L的D-gal(500 mg/kg)、9 g/L的亚硝酸钠(45 mg/kg)，颈背部皮下注射；同时给予三氯化铝(40 mg/kg)灌胃；连续3周。对照组以相同给药方式给予等量无菌生理盐水。

1.3.2跑台运动干预：对运动干预组实施中等强度有氧运动干预。①适应性跑台训练：第1天运动速度为每分钟12 m，训练时间为20 min；随后运动速度不变、训练时间每天增加10 min，直至60 min/d，共5 d。②正式训练：坡度为0°，第1周运动速度设定为每分钟15 m，以后每1周增加运动速度(每分钟增加3 m)，直至每分钟24 m；每天训练60 min，每周连续训练5 d，共训练3周。

1.4检测指标及方法

1.4.1行为学测试：①定位航行实验：记录3组大鼠找到平台所用的时间(逃避潜伏期)；若>60 s未找到平台则计逃避潜伏期为60 s；连续5 d。②空间探索实验：定位航行实验结束后次日撤除平台，记录3组大鼠第1次穿越原平台位置时间及在目标象限活动时间。

1.4.2海马取材、固定：水迷宫实验结束后，断头取脑，迅速分离并取下海马组织。取3组小鼠一侧海马组织(左侧或右侧，随机)装入EP管，投入液氮中，用于ELISA等检测；另一侧海马组织投入4%的多聚甲醛溶液中固定过夜，用于染色标本的制作。

1.4.3海马匀浆ChAT、AchE活性及Aβ42含量测定：从液氮中取出海马组织，平衡温度后称重，按质量/体积比(1∶9)加入4℃生理盐水匀浆。匀浆液置于离心机(转速3000 r/min、半径13.5 cm)中离心15 min，取上清分装于EP管，置于-20℃冰箱待测。按试剂盒说明，用ELISA检测海马匀浆中ChAT、AchE活性及Aβ42含量。

1.4.4海马切片制备及染色：将海马组织在多聚甲醛中过夜，于次日行石蜡包埋，制作石蜡切片，连续冠状位切片，厚度为10 μm。一部分切片做HE染色；另一部分切片按照改良Bielschowsky神经染色液说明书进行银染：将切片浸染于银溶液中，之后用还原剂处理，使神经元、轴突及神经纤维呈现深棕色或黑色。

2 结果

2.1小鼠学习记忆能力比较 与对照组相比，MCI模型组小鼠逃避潜伏期、第1次穿越原平台位置时间延长，在目标象限活动时间缩短，差异均有统计学意义(P<0.05)。与MCI模型组比较，运动干预组逃避潜伏期、第1次穿越原平台位置时间缩短，在目标象限活动时间延长，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 3组小鼠学习记忆能力比较

2.2小鼠海马匀浆ChAT、AchE活性及Aβ42含量比较 与对照组比较，MCI模型组海马ChAT表达水平明显降低，而AchE、Aβ42表达水平明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。与MCI模型组比较，运动干预组海马ChAT表达水平明显升高，而AchE、Aβ42表达水平明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 3组小鼠脑匀浆ChAT、AchE活性及Aβ42含量比较

2.3小鼠海马组织病理学改变 对照组海马CA1区锥体细胞结构清晰，神经纤维排列整齐。MCI模型组海马CA1区锥体细胞密度下降，部分细胞核固缩、深染，可见少量的细胞凋亡，神经纤维排列稍稀疏。运动干预组海马CA1区锥体细胞密度增加，细胞结构及神经纤维排列清晰、有序，未见凋亡细胞。见图1。

图1 3组小鼠海马组织病理学改变(HE×400，15个)

2.4小鼠海马神经元纤维和Aβ斑的形态比较 对照组海马CA1区锥体细胞排列整齐，其神经元纤维清晰、规则、呈棕黑色，且伸入细胞突起内；细胞外未见Aβ斑。MCI模型组海马CA1区锥体细胞稍稀疏，部分细胞出现核固缩，细胞神经元纤维稍增粗、模糊；细胞外未见Aβ斑。运动干预组海马CA1区锥体细胞排列有序，细胞神经元纤维清晰；细胞外未见Aβ斑。见图2。

图2 3组小鼠海马神经元纤维和Aβ斑病理形态(Bielschowsky×400，15个)

3 讨论

随着我国老龄化进程的加剧，AD已成为危害老年人身心健康的严重社会公共问题；AD发病机制不明，尚无有效药物和治疗技术[14-15]。目前基于Aβ毒性学说开发的抗AD药物在临床三期试验中失败，让更多研究团队将注意力投入到探索MCI干预途径和机制上，试图从源头上防治AD。

D-gal是一种还原糖，在正常浓度状态下代谢生成葡萄糖，而高剂量时形成活性氧簇如超氧阴离子、羟自由基、过氧化氢等及高级糖化终末产物，通过氧化应激等机制，产生神经毒性效应，引起海马神经元退行性病变[16-17]。铝是一种慢性神经毒素，三氯化铝除介导脂质过氧化外，还可以引起脑组织神经元纤维变性、β-淀粉样蛋白的过表达[18]。亚硝酸钠的氧化性导致血红蛋白失去携氧输氧功能，使脑组织产生缺氧性中毒。本课题组前期研究表明，D-gal、亚硝酸钠和三氯化铝三者复合慢性作用是建立AD动物模型的比较理想的方法[8-9,19]。

本研究结果显示，与对照组比较，MCI模型组逃避潜伏期、第1次穿越原平台位置时间延长，在目标象限活动时间缩短；海马ChAT水平明显降低，而AchE、Aβ42水平明显升高；MCI模型组海马CA1区锥体细胞密度下降，部分细胞核固缩、深染，少量细胞凋亡，神经纤维也排列稍稀疏；银染示MCI模型组海马CA1区锥体细胞稍稀疏，部分细胞出现核固缩，细胞神经元纤维稍增粗、模糊；细胞外未见Aβ斑。与刘梅讯和孙天敏[8]、陈婷[9]报道结果一致，出现了轻度学习记忆损害、轻度胆碱能系统受损、轻度APP/Aβ代谢紊乱及轻度神经病理学变化，即“四轻”效度变化，由此判断MCI小鼠模型复制成功一致。“四轻”效度变化是MCI模型的特征，因此区别了AD模型；如MCI模型组小鼠海马匀浆Aβ42水平明显升高，但在海马区细胞外未发现Aβ斑。

本研究结果显示，与MCI模型组比较，运动干预组小鼠逃避潜伏期、第1次穿越原平台位置时间缩短，在目标象限活动时间延长；海马ChAT表达水平明显升高，而AchE、Aβ42表达水平明显降低；HE染色，运动干预组海马CA1区锥体细胞密度增加，细胞结构及神经纤维清晰、有序，未见凋亡细胞；银染示运动干预组海马CA1区锥体细胞排列有序，细胞神经元纤维清晰；与既往文献结果一致。提示运动干预可以逆转MCI模型小鼠的“四轻”效度变化，其可能机制是：运动训练不仅可以改善大脑皮质和海马组织的血液循环，而且还可以拮抗炎症反应，增加海马结构脑源性神经营养因子表达，诱导海马神经发生改变，从而改善海马区病理学改变，提高MCI模型小鼠的认知功能[19-22]。

综上所述，本研究采用D-gal、三氯化铝和亚硝酸钠三者联合对老年小鼠给药3周，复制了小鼠MCI“四轻”效度变化，构建了MCI小鼠模型；并对MCI模型小鼠实施3周跑台运动干预，基本逆转了MCI模型小鼠的“四轻”效度变化。这表明，运动训练可以明显改善MCI模型小鼠海马组织的病理学改变，从而提高其学习记忆能力。