大黄酸对小鼠非酒精性脂肪肝病的治疗效果分析

林晓平， 余立华

海军军医大学基础医学院基础医学实验教学中心， 上海 200433

非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一种无过量饮酒史、肝细胞内脂肪过度沉积为主要特征的临床病理综合征。随着肥胖症的发病率逐年升高，NAFLD的发病率也不断攀升。流行病学的数据[1]表明，约25%的美国人罹患NAFLD，其中30%进展为非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，而约20%NASH患者最终会发展为肝硬化。近年来，我国的NAFLD患病率逐年增长。一项meta分析[2]的结果表明，2000年至2006年我国大陆地区所报道的NAFLD患病率为18.22%(95%CI 14.32%～22.48%)，而2007至2009年所报道的NAFLD患病率为20.00% (95%CI 16.84～23.36)，2010至2013年患病率上升至20.68% (95%CI 17.28%～24.30%)。尽管目前仍缺少大陆地区NAFLD进展为NASH甚至是肝硬化的确切百分比，但可以预见的是，未来30～50年内由NAFLD导致的终末期肝病所带来的医疗负担不容忽视。

目前针对NAFLD的治疗，可选择的药物较少，如胰岛素增敏剂、抗氧化剂、降脂药和护肝药等[3-4]，且多属于对症支持药物，缺乏特异性药物。近年来，研究者[5-8]利用全基因组关联分析的方法(genome-wide association study, GWAS)确定肥胖相关基因(fat mass and obesity associated gene，FTO)是导致人类肥胖的候选基因。多项研究[5-6]结果表明，FTO基因的多态性位点与成人、儿童的体质量指数、体质量增长、脂肪含量增加等相关。而在NAFLD患者的肝组织中FTO的表达量显著增高[7]。然而FTO在肥胖症及NAFLD发生、发展过程的作用机制并不确切。最近，有研究者[8]发现，FTO是RNA 的m6A去甲基化酶，植物提取物大黄酸(rhein)在体外可竞争性地与FTO去甲基化酶活性位点结合，且对细胞内的m6A去甲基化过程也有较好的抑制作用。

因此，本研究拟观察rhein对高脂饮食导致的小鼠NAFLD的治疗效果，旨在为NAFLD治疗提供新的选择。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与药品 Rhein购自上海源叶生物，其纯度为HPLC≥98%。高脂小鼠饲料购自戴茨生物科技(无锡)有限公司。FTO抗体购自英国Abcam 公司。二抗为Rdye800标记的羊抗兔IgG 和 IRdye700 标记的羊抗鼠IgG (Li-Cor公司)。油红染色试剂购自上海翊圣生物科技有限公司。

1.2 NAFLD小鼠模型及治疗 无特定病原体(SPF)级雄性C57BL/6小鼠30只，由海军军医大学实验动物中心提供。随机分为3组：普饲组，高脂组，高脂+rhein组。根据以往的文献报道[9-10]，rhein用PBS配置成5 g/L混悬液，隔天固定时间120 mg·kg-1·d-1灌胃，非rhein组均予等量PBS灌胃。

1.3 观察指标及检测方法 每周进行小鼠称重并记录，并于实验开始后的第2周测量计算每组小鼠在3 d内的摄食量，并连续测量21 d。第7周结束后，从眼眶静脉取血，按常规制备血清标本。常规方法处死小鼠后迅速取出肝脏，从肝右叶中部取肝组织2块，其中一块按常规制备肝组织冰冻切片标本，另一块用液氮进行速冻后存入-80℃冰箱中用于Western印迹检测。(1)生化分析：采用全自动生化分析仪检测丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶、低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)。(2)油红染色：取出预先制备好并保存在-20℃冰箱中的冰冻切片，放置在室温回温5～10 min；按照贮备液∶稀释液=5∶2的比例配制染色液，并用滤纸慢速过滤备用；冰冻切片置入染色液中15 min，此后37℃蒸馏水中漂洗15 s；并复染5 min，水洗45 s；封片后即进行镜检。(3)组织蛋白表达水平检测：采用Western印迹方法检测组织中蛋白的表达水平。组织分组同上，使用RIPA裂解液裂解组织得到总蛋白，使用BCA法定量蛋白浓度，使用SDS-PAGE进行蛋白电泳，并电转至硝酸纤维素膜，使用脱脂奶粉溶液封闭过夜，次日加入相应二抗孵育(带荧光)后使用Odyssey (Li-Cor公司)进行扫描，定量检测FTO蛋白表达水平。选用β-actin作为定量的内参。

2 结 果

2.1 小鼠体质量及摄食量的改变 自实验开始的第2周，连续21 d测定每组小鼠(10只)在3 d内的摄食量。结果(图1A)显示，与普饲组比较，高脂组小鼠的摄食量明显降低(P<0.01)， rhein灌胃后，小鼠摄食量并没有明显恢复。每周在相同时间点称重小鼠体质量。与高脂组比较，高脂+rhein组小鼠体质量增加明显减缓(图1B)。在第7周，高脂+rhein组小鼠的体质量明显低于高脂组(P<0.05)。

图1 实验过程中各组小鼠摄食量及体质量的改变A：图中的每一点代表10只小鼠在3 d内的摄食量。自第2周开始，每3 d进行一次测量，连续测量了21 d；B：每周在固定时间点测量小鼠体质量. Control： 普饲组； HFD： 高脂组； HFD+rhein： 高脂+rhein组. **P<0.01，*P<0.05

2.2 小鼠肝脏脂肪沉积的改变 在实验7周结束后，取各组小鼠的肝组织进行H-E染色以确定肝脏组织中脂肪沉积情况。结果(图2)显示：在高脂组小鼠肝细胞中脂肪空泡明显多于普饲组，表明非酒精性脂肪肝病造模成功。而与高脂组比较，高脂+rhein组小鼠肝细胞中脂肪空泡明显减少，表明rhein有减少肝细胞脂肪沉积的作用。为了进一步验证上述结果，采用油红对肝细胞中的沉积脂肪进行染色。高脂组小鼠肝细胞中脂肪沉积明显多于普饲组，rhein灌胃的小鼠肝细胞中脂肪沉积明显减少。

图2 各组小鼠肝脏组织中脂肪沉积情况A：3组H-E染色和油红染色结果. B：使用 Image J软件对油红染色照片中染色信号进行定量分析(n=3). Control：普饲组；HFD：高脂组；HFD+rhien：高脂+rhien组

2.3 小鼠肝功能的改变 为进一步验证rhein是否可以影响肝脏脂质代谢及肝功能，在实验7周结束后，留取各组小鼠的血清，并测量ALT、AST、LDL和HDL。实验结果(图3)显示，在高脂组小鼠中肝功能明显受损，而采用rhein灌胃后，小鼠的肝功能有明显恢复(图3A、3B)。LDL和HDL测量的结果(图3C、3D)显示，与普饲组的小鼠比较，高脂组小鼠脂肪代谢明显紊乱。

图3 各组小鼠血清中ALT、AST、LDL和HDL浓度改变Control： 普饲组; HFD: 高脂组; HFD+rhein: 高脂+rhein组. **P<0.01，*P<0.05

2.4 小鼠肝脏组织中FTO表达量的改变 结果(图4)显示，FTO蛋白在高脂组小鼠的肝组织中显著增多，而在高脂+rhein组小鼠肝组织中FTO蛋白的表达量明显回落。

图4 Western blot检测各组小鼠肝组织中FTO蛋白表达量 Control: 普饲组; HFD: 高脂组; HFD+rhein: 高脂+rhein组

3 讨 论

随着社会经济发展及生活方式变迁，肥胖症、高血压、糖尿病、NAFLD等慢性疾病对人类健康的危害越来越引起重视。NAFLD如得不到有效控制，相当大比例的患者会进展为NASH，甚至是肝硬化。已有研究[9-10]表明，NAFLD具有一定的遗传易感性，多个GWAS研究结果[11-12]显示，SNP位点可增加NAFLD的患病风险。更重要的是，饮食结构改变、运动量减少等环境因素是导致NAFLD发病的主要危险因素。

然而，目前针对NAFLD治疗的方案多半不具有特异性，以对症支持治疗为主，如降脂、抗炎、抗氧化等。一方面，治疗的效果有待商榷；另一方面，这些治疗措施可能会带来其他不良反应。之所以缺少特效药，是因为目前人们对NAFLD的进展机制及干预的靶点并不清楚。20余年前人们就已经发现FTO基因的多态性与肥胖症相关。近年来，研究者[8]发现FTO可作为RNA m6A 去甲基化酶而发挥着重要作用。特别是多项研究[13-14]表明，FTO的高表达会促进血液系统肿瘤、乳腺癌等多种恶性肿瘤的发生与进展。众所周知，NAFLD可能会进展为NASH，从而启动肝脏的慢性炎症过程，激活肝脏组织中的星状细胞，促进纤维化过程，最终导致肝硬化、原发性肝细胞癌。已有文献[7]称，FTO在NAFLD患者的肝组织明显上调表达，表明FTO可能是阻断该病进展的干预靶点。

Rhein中文名大黄酸，是植物提取物。一直以来作为减肥药、抗炎药、抗肿瘤药而被广泛探讨。也有研究[15-16]表明，rhein可改善高脂饮食所导致的大鼠NAFLD。本研究结果也表明，rhein可以减少NAFLD过程中肝细胞中脂肪沉积，促进肝功能恢复，具有明确的NAFLD治疗效果。然而，rhein作用的靶点并不明确。近期研究[8]表明，rhein在体外可竞争性地与FTO去甲基化酶活性位点结合，并且抑制其去甲基化酶的作用，这一发现为rhein作用靶点的确定提供了机会。本研究发现NAFLD会导致肝组织中FTO蛋白表达上调，而在rhein的作用下FTO蛋白表达水平明显下调，这些结果表明，rhein可能通过减少FTO蛋白的表达而改善NAFLD患者肝脏组中脂肪沉积以及肝功能损害。可见，rhein可作为NAFLD治疗的药物。

本研究也存在一定的局限性：首先，本研究仅仅是动物实验，对rhein的有效剂量范围，可能存在的不良反应，在人类NAFLD治疗中是否有效等问题，目前仍然没有解决，还需要更进一步的系统研究。第二，本研究发现rhein可减少NAFLD小鼠肝组织中FTO蛋白表达量，但其机制并不清楚。更重要的是，除了FTO可能是rhein作用的靶点，rhein在NAFLD治疗中其他的作用靶点也不明确。