精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸修饰的星型高分子负载雷珠单抗对脉络膜新生血管靶向治疗作用△

胡伟男 蔡文婷 邹爱琪 朱美江 刘畅 于靖

年龄相关性黄斑变性(AMD)是导致老年人不可逆性视力丧失的主要原因之一[1],据统计，目前全世界约有2100万AMD患者[2]。大多数严重视力丧失的患者是渗出型AMD，其特征是脉络膜新生血管(CNV)生长到视网膜色素上皮(RPE)下间隙[3]。CNV主要由血管内皮生长因子(VEGF)驱动[4]。目前临床治疗的标准方法为玻璃体内注射抗VEGF药物[5]。然而，反复进行玻璃体内注射存在发生眼内炎、高眼压等并发症的风险，一旦发生将导致严重的视力下降[6]。因此，寻找一种安全可靠的给药方式是当务之急。聚乙二醇(PEG)具有良好的溶解性及亲水性，且无毒、无免疫原性、易化学修饰，可进行多官能团修饰，是一种很有前途的纳米载体，可用于治疗性药物传递、基因传递及CT/MR成像[7]。本研究首先合成了PEG星型高分子(S-PPEGMA10，S-PEG)聚合物作为载体，然后用精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)和吲哚菁绿(ICG)对其进行修饰，并负载抗VEGF药物雷珠单抗(RBZ)，形成纳米粒子S-PEG-ICG-RGD-RBZ NPs(SPIRR NPs)用于CNV的治疗，为寻求新的给药方式提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物健康雄性C57BL/6小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)106只，6～8周龄,体质量25～30 g。所有动物均严格按照视力和眼科协的声明《视力与眼科动物研究使用说明》和上海市第十人民医院《动物研究使用指南》的规定进行护理和使用，并严格遵守国家卫生和医学研究委员会对实验用动物护理和使用制定的相关指南。

1.2 主要试剂和仪器PEG甲基丙烯酸酯[PEGMA(Mn=300)]、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、链转移剂(CTA)、二环己基碳二亚胺(DCC)(美国Sigma-Aldrich公司)；ICG-NH2(美国AAT Bioquest公司)；人RPE细胞系ARPE-19(上海赛百慷生物技术股份有限公司)；DMEM/F12培养基(美国Hyclone公司)；人脐静脉内皮细胞(HUVEC)(上海中乔新舟生物科技有限公司)；内皮细胞培养液(ECM)和内皮细胞生长补充剂(ECGs)(美国ScienCell公司)；胎牛血清(FBS)(美国HyClone公司)；CCK-8试剂盒(上海翊圣生物科技有限公司)；40 g·L-1多聚甲醛(武汉谷歌生物科技有限公司)；戊巴比妥钠(上海博蕴生物科技有限公司)；盐酸丙美卡因滴眼液(美国爱尔康公司)；钾(K+)、氯(Cl-)、钙(Ca2+)离子试剂盒(南京建成研究所)。紫外可见分光光度计(美国PerkinElmer公司)；纳米粒度和电位分析仪(英国Malvern仪器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 SPIRR NPs纳米粒子的合成与表征检测

1.3.1.1 SPIRR NPs的合成以PEGMA为原料，在二恶烷中进行RAFT聚合，合成L-PEG，再采用RAFT分散聚合法在水/乙醇溶液中合成S-PEG，将荧光基团ICG与S-PEG结合得到S-PEG-ICG。称取0.18 g S-PEG-IGC溶解在2 mL MES缓冲液中，加入30 mg NHS和50 mg EDC搅拌30 min，加入10 mg RGD和11.5 mg RBZ继续反应2 d，然后在水相中透析(MWCO=3000)3 d，得到的澄清透明溶液经过过滤后，冷冻干燥得到最终产物SPIRR NPs。

1.3.1.2 表征检测(1)水合粒径：分别称取S-PEG和SPIRR NPs粉末各1.0 mg溶解在超纯水中，采用Nano-ZS型纳米粒度分析仪测试纳米材料的水合粒径；(2)Zeta表面电势：分别称取制备得到并纯化后的S-PEG、S-PEG-ICG和SPIRR NPs粉末各1.0 mg溶解在超纯水中，采用Zeta电位分析仪测试纳米材料的表面电势；(3)紫外吸收光谱：将制备得到并纯化后的S-PEG、S-PEG-ICG和SPIRR NPs粉末各1.0 mg溶解在超纯水中，测试紫外吸收光谱，扫描范围为200～1000 nm。

1.3.2 细胞实验

1.3.2.1 细胞水平SPIRR NPs生物安全性的验证将ARPE-19细胞以每孔5000个的密度接种于96孔板中，过夜培养使其贴壁生长。第2天移除上清液后在每孔中加入不同浓度(0 μmol·L-1、5 μmol·L-1、10 μmol·L-1、25 μmol·L-1、50 μmol·L-1、100 μmol·L-1)的SPIRR NPs，继续培养24 h后移除上清液，再于每孔中加入10 μL CCK-8溶液和100 μL无血清培养基，孵育2 h后酶标仪检测，在波长450 nm处测量各孔吸光度(D)值。

1.3.2.2 SPIRR NPs对VEGF诱导的HUVEC管腔形成的影响将培养的HUVEC分为四组，分别为正常对照组：正常培养细胞；VEGF干预组：向培养的HUVEC中加入20 μmol·L-1VEGF进行干预；低浓度治疗组：向培养的HUVEC中加入20 μmol·L-1VEGF 进行干预，同时加入50 μmol·L-1SPIRR NPs进行治疗；高浓度治疗组：向培养的HUVEC中加入20 μmol·L-1VEGF 进行干预，同时加入100 μmol·L-1SPIRR NPs进行治疗。将细胞以每孔300×103个接种于6孔板中，按照上述分组处理后培养24 h。将干预后的各组细胞重悬，按照每孔5×103个加入固化了35 μL Matrigel基质胶的96孔板中，放入培养箱中孵育6 h后取出，在倒置显微镜下拍照，最后利用Image J软件分别计算管腔节数、节点数、节段数和相对管腔长度，实验重复3次。

1.3.3 动物实验

1.3.3.1 激光诱导CNV小鼠模型的建立小鼠均选右眼造模。小鼠腹腔注射10 g·L-1戊巴比妥钠(40 mg·kg-1)麻醉后，应用5 g·L-1复方托吡卡胺滴眼液散瞳，盐酸丙美卡因滴眼液表面麻醉，暴露右眼，使用滴加氧氟沙星眼膏的载玻片作为接触镜，于激光机下进行造模。采用532 nm的激光光凝，激光强度150 mW，持续时间0.05 s，光斑大小50 μm。光凝位置为距视盘等距离的2支视网膜血管间，光凝4～6个点，光凝后出现气泡或轻度出血视为造模成功。

1.3.3.2 实验动物分组将小鼠分为5组，分别为对照组(n=26)：正常C57BL/6小鼠；PBS组(n=20)：激光光凝7 d后，尾静脉注射50 μL 1×PBS；S-PEG组(n=20)：激光光凝7 d后，尾静脉注射50 μL S-PEG；SPIRR组(n=26)：激光光凝7 d后，尾静脉注射50 μL 1 g·L-1SPIRR NPs；RBZ组(n=20)：激光光凝7 d后，玻璃体内注射1 μL 10 g·L-1RBZ。

1.3.3.3 眼底照相与FFA检查激光造模后按照上述分组对小鼠进行干预，干预后28 d，使用10 g·L-1戊巴比妥钠麻醉小鼠，复方托吡卡胺散瞳，对各组小鼠进行眼底照相，再于腹腔内注射 0.2 mL 10 g·L-1荧光素钠进行FFA检查，并采集图像。

1.3.3.4 眼底ICGASPIRR组小组激光光凝后7 d，于鼠尾静脉注射SPIRR NPs，并于激光光凝后0 d、7 d、14 d、28 d、90 d，采用1.3.3.3方法对小鼠进行麻醉散瞳后，使用造影机ICGA模式进行照相采集。

1.3.3.5 CNV面积的测量除SPIRR组保留6只小鼠观察外，其余各组小鼠均于干预后28 d使用10 g·L-1戊巴比妥钠麻醉后，暴露心脏，于右心房处剪一小口，从左心室快速推注20 mL 1×PBS溶液，再注入0.2 mL FITC-dextran溶液(25 g·L-1)，见小鼠四肢、尾巴出现黄染后，推注20 mL 40 g·L-1多聚甲醛进行固定。随后摘取眼球，在角巩膜缘处扎一小孔，浸入FSA眼球固定液中固定2 h，完成后于显微镜下去除除RPE-脉络膜-巩膜外所有组织，并以视盘为中心分为大致相等的4个象限，视网膜部分朝上。IB4抗体(11000)染色30 min。随后用1×PBS漂洗3次，置于干净的载玻片上，滴加抗淬灭剂后封片，将载玻片放在荧光显微镜下观察，记录铺片上的CNV病灶。CNV面积用Image J软件测量。

1.3.3.6 动物水平SPIRR NPs生物安全性的验证小鼠按上述分组干预28 d摘取眼球时，于伤口处采集血样。血清以4600 r·min-1离心10 min，取上清液-80 ℃保存备用。使用南京建成生物工程研究所在售商业试剂盒检测以下指标：(1)肝功能：丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)；(2)肾功能：肌酐(Cr)；(3)血脂：总胆固醇(T-CHO)、甘油三酯(TG)；(4)电解质：K+、Ca2+、Cl-。

1.3.4 溶血试验在上海市第十人民医院招募健康成人志愿者10人，于空腹8 h后采集静脉血，加生理盐水离心，弃上清，重复操作至上清液无色，弃上清，将底部沉淀的红细胞用生理盐水重悬成体积分数为2%的红细胞悬液。分别在2 mL 1.25～10.00 g·L-1SPIRR NPs、生理盐水(阴性对照)及ddH2O(阳性对照)中加入2 mL红细胞悬液，37 ℃下混匀孵育30 min。离心机3000 r·min-1离心5 min，收集上清液。酶标仪540 nm下测定各组D值，并按照公式计算溶血率：溶血率=(D试验组-D阴性对照组)/(D阳性对照组-D阴性对照组)×100%。

1.3.5 统计学处理采用SPSS 19.0软件和GraphPad Prism Version 5进行统计学分析，多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)。检验水准：α=0.05。

2 结果

2.1 SPIRR NPs的表征检测由于粒子簇的形成，SPIRR NPs纳米粒子表现出比S-PEG大得多的流体力学尺寸。S-PEG、S-PEG-ICG和SPIRR NPs的Zeta电势分别为(-4.74±1.56)mV、(-3.79±0.47)mV和(-2.42±0.13)mV。基于UV-Vis光谱，ICG单元成功偶联到S-PEG表面，S-PEG-ICG和SPIRR NPs纳米粒子的表面等离子体共振峰几乎没有明显差异(图1)。

图1 各材料表征实验检测结果 A：S-PEG的平均粒径；B： SPIRR NPs的平均粒径；C：各材料的Zeta电势；D：各材料的紫外-可见光谱。

2.2 SPIRR NPs对细胞活性的影响CCK-8法检测结果显示，0 μmol·L-1、5 μmol·L-1、10 μmol·L-1、25 μmol·L-1、50 μmol·L-1、100 μmol·L-1的SPIRR NPs处理ARPE-19细胞24 h后,细胞存活率分别为0.89±0.01、0.87±0.05、0.85±0.04、0.89±0.07、0.89±0.07、0.85±0.04,各浓度组细胞存活率间差异均无统计学意义(均为P>0.05)。

2.3 SPIRR NPs对VEGF诱导的HUVEC管腔形成的影响管腔形成实验结果(图2)显示，当给予SPIRR NPs干预后，VEGF诱导的管腔形成被有效抑制。计算各组的管腔节数、节点数、节段数及相对管腔长度结果显示，正常对照组、VEGF干预组、低浓度治疗组、高浓度治疗组管腔节数分别为55.00±16.00、110.00±13.00、44.67±14.36及25.33±17.00，管腔节点数分别为16.00±4.58、31.67±5.51、12.67±5.03及8.00±5.20，管腔节段数分别为20.67±7.37、45.33±8.08、14.33±6.03及7.67±6.66，相对管腔长度分别为1.00±0.00、1.51±0.08、0.97±0.18及0.75±0.15。与正常对照组相比，VEGF干预组管腔节数、节点数、节段数以及相对管腔长度均有大幅度增加，差异均有统计学意义(均为P<0.05);与VEGF干预组相比，低浓度治疗组、高浓度治疗组HUVEC的管腔节数、节点数、节段数及相对管腔长度均降低，差异均有统计学意义(均为P<0.05)；低浓度治疗组与高浓度治疗组间各指标相比，差异均无统计学意义(均为P>0.05)。可见，与正常对照组相比，VEGF诱导后的HUVEC存在明显的管腔变化，而在应用不同浓度SPIRR NPs治疗后，VEGF诱导的管腔变化被有效抑制，管腔形成被显著逆转。

图2 各组管腔形成实验结果 A：正常对照组；B：VEGF干预组；C：低浓度治疗组；D：高浓度治疗组。

2.4 SPIRR NPs的靶向作用ICGA检测SPIRR NPs注射前及注射后不同时间点在CNV部位的显影结果见图3。由图3可见，CNV病灶处出现荧光，表明SPIRR NPs可靶向至CNV病灶；随着时间的增加，荧光强度逐渐减弱，最终可保持90 d左右，表明SPIRR NPs可以在CNV部位长期存在并工作。

图3 ICGA检测SPIRR NPs注射前及注射后不同时间点在CNV部位的显影 A：造模后7 d药物注射时；B：造模后14 d；C：造模后28 d；D：造模后90 d。

2.5 静脉注射SPIRR NPs对小鼠CNV形成的影响FFA检测结果(图4)可见，对照组与PBS组在CNV处荧光面积大小相似，无明显差异，而SPIRR组和RBZ组CNV处的荧光渗漏面积明显减小。视网膜-脉络膜-巩膜铺片FITC-dextran和IB4染色结果显示(图5)，PBS组、S-PEG组、SPIRR组和RBZ组CNV病变面积分别为(12 923.18±3325.11)μm2、(13 106.10±3660.18)μm2、(2403.31±320.43)μm2和(2529.60±139.08)μm2，两两比较结果显示，PBS组与S-PEG组、SPIRR组与RBZ组间CNV病变面积差异均无统计学意义(均为P>0.05)，其余组间两两相比差异均有统计学意义(均为P<0.05)。

图4 FFA观察各组CNV部位荧光渗漏情况 A：各组FFA检查结果；B：A图荧光渗漏部位放大图。

2.6 SPIRR NPs对血清指标的影响各组小鼠血清中ALT、AST、Cr、T-CHO、TG、K+、Ca2+、Cl-水平差异均无统计学意义(均为P>0.05)。SPIRR NPs浓度在1.25～10.00 g·L-1时的溶血试验结果均为阴性，其中10.00 g·L-1时的溶血率为(0.95±0.52)%，未超过国际公认标准10%(图6) 。

图5 FITC-dextran灌注荧光染色与IB4双染观察各组RPE-脉络膜-巩膜铺片CNV病灶大小

图6 各组小鼠血清学检测结果 A：肝肾指标ALT、AST、Cr检测结果；B：血脂指标T-CHO、TG检测结果；C：电解质K+、Ca2+、Cl-检测结果。NS：差异无统计学意义。

3 讨论

湿性AMD由于其会在黄斑区出现CNV导致黄斑出血、水肿，进而引发视力下降，现已成为影响中老年人视力的主要因素之一[8]。已有研究发现,在AMD患者的新生血管内皮细胞中检测到高表达的整合素αvβ3[9]，而RGD能够与αvβ3特异性结合。同时，表面修饰RGD多肽的脂质体能够转载光敏剂或抗VEGF药物，通过静脉注射的方式来达到治疗CNV效果[10]。而PEG作为核交联星型高分子一员，不仅具有高度交联的核，“臂”的数目也更多，具有的独特构型可以增加药物的稳定性和偶联物在血液中的滞留时间，目前作为纳米载体已经广泛应用于生物医药领域[11]。Li等[12]构建了在中性pH条件下也能响应的纳米给药平台，利用PEG作为外壳包覆抗坏血酸纳米球，以增强其在肿瘤组织中的渗透和滞留效应。Zhao等[13]利用PEG为载体结合HPV16E7肽和CpGODN，组装成了稳定且具有高载药量的LipE7/CpG疫苗，通过增强细胞免疫和改善肿瘤相关免疫抑制而发挥抗肿瘤作用，同时通过形态学实验证实该疫苗未引起主要器官的形态学改变，无明显毒性反应，能够安全用于体内实验的研究。因此本研究以PEG为原料行RAFT反应，成功制备得到了以星型高分子为载体、键载RGD靶向基团，并负载抗VEGF药物的纳米颗粒SPIRR NPs。

纳米颗粒具有功能化结构及易于修饰等优点，然而其潜在毒性是纳米颗粒在应用前需要考虑的一个问题，已有文献[14]报道，阳离子树状大分子破坏细胞膜的结构具有细胞毒性，可诱导细胞坏死。 Barrios-Gumiel等[15]通过改变树状大分子的生成和树状大分子/PEG的比例来达到聚乙二醇基化纳米颗粒的目的，降低了树状大分子固有的分子毒性。因此，在本研究中，我们增加了PEG在纳米颗粒中的比例， 细胞实验证明SPIRR NPs并未影响细胞存活率，与前期报道结果一致，为进一步研究其疗效提供了实验基础。

溶血主要是由于外因引起的红细胞通透性升高使得细胞裂解，导致血红蛋白的释放。溶血试验是评估静脉注射制剂能否安全应用的一项重要指标，Zhong等[16]利用溶血试验评估了纳米氧化锌/壳聚糖微球的生物安全性。本研究通过溶血试验证明，在研究浓度范围内，即使纳米颗粒浓度增加到10.00 g·L-1，溶血率仍然远低于1.0%，证明该纳米颗粒具有很好的血液相容性，能够安全用于静脉注射。

正常情况下，静脉制剂注射后会通过血液进入全身循环，肝脏和肾脏是人体重要的代谢器官，我们参考Vangaveti等[17]的方法，使用血清学检测来评价器官的毒性，结果显示，各血清学指标并没有明显增加，也没有明显的统计学上的变化。因此认为该纳米材料具有很好的生物相容性。

血管生成被定义为从原有血管中形成新的毛细血管，成纤维细胞通过分泌细胞外基质和局部释放VEGF促使内皮细胞发生活化和迁移，突破Bruch膜向视网膜下迁移，迁移后的内皮细胞继续增殖形成了管腔，最终形成了新生血管，造成了CNV的发生[18]。Zhang等[19]研究发现，VEGF诱导后的HUVEC可观察到明显的管腔形成，这与新生血管的形成过程是一致的。Suzuki等[20]报道，抑制VEGF介导的管腔形成可以减少新生血管的形成，从而延缓CNV的发展。我们通过实验观察发现，在应用SPIRR NPs后，VEGF诱导的管腔形成被显著抑制，可见管腔节数减少、长度缩短等现象。

在本研究中，我们使用了视网膜激光光凝的CNV小鼠作为动物模型来完成体内实验。实验结果证明，激光诱导CNV作为一种依赖于VEGF因子的造模方式，其过程可以被抗VEGF药物抑制，因此激光诱导的CNV模型被广泛应用[21]。抗VEGF药物的应用已经被认为是CNV的一线治疗策略，其中包括单克隆抗体片段雷珠单抗和单克隆抗体贝伐单抗等。雷珠单抗是一种高亲和力的重组Fab，可以中和所有亚型的VEGF-A[22]。最近有研究显示，雷珠单抗可以有效减少激光诱导动物模型中的CNV面积[23]。通过RPE-脉络膜-巩膜铺片FITC-dextran和IB4染色及FFA观察CNV病灶大小，结果均显示尾静脉注射SPIRR NPs后的病灶显著减少。

综上所述，RGD修饰的S-PEG被设计为一种强有力的载体，可以将抗VEGF药物输送到CNV区域。体外实验中，我们所合成的SPIRR NPs无细胞毒性，在所研究的浓度范围内不诱导细胞凋亡，对VEGF诱导的HUVEC的管腔形成具有显著的抑制效果。体内实验中，较低的溶血率使之可安全地用于静脉注射，同时不影响肝、肾功能，脂代谢和电解质等重要指标，保证了其被进一步应用的生物安全性。更重要的是，抗VEGF药物可以被靶向输送到CNV区域，并在那里停留较长时间，以维持抗VEGF的效果。通过各种实验观察可见CNV面积显著减少，总体而言，SPIRR NPs具有良好的细胞相容性，在CNV治疗中具有很大的药物输送潜力。