动物布鲁氏菌病抗体补体结合试验与cELISA检测结果比较

沈红霞，倪柏锋，王 彬，虞一聪，周 炜，周芷锦，穆 琳，桂平雄，赵灵燕

(浙江省动物疫病预防控制中心，浙江 杭州 311199)

布鲁氏菌病血清学检测方法主要有平板凝集试验(BPAT)、虎红平板凝集试验(RBPT)、试管凝集试验(SAT)、补体结合试验(CFT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)和荧光偏振试验(FPA)等,以补体结合试验诊断布病的特异性最强，其敏感性也较高，是国际公认的血清学确诊方法。

补体结合试验包括两个系统，并需要5种成分。第一个系统是反应系统，将布鲁氏菌抗原与被检血清以及补体混合，如果被检血清含有布病抗体，抗体与布鲁氏菌抗原结合形成复合物，抗体的分子构型改变，处于Fc段上的补体结合位点暴露，这时补体与之结合，结合的补体不再游离，使其不能再参与第二指示系统即溶血系统反应。在加入被致敏的绵羊红细胞(即与溶血素结合的红细胞)时，由于所有补体已在第一系统反应时被结合，则不会发生溶血，即判定为阳性反应；反之则会发生溶血，判定为阴性反应[1]。本文着重介绍了补体结合试验实验方法，并将其结果与cELISA结果进行比较，以供同行参考。

1 材料

1.1仪器设备 培养箱(4111，Thermo)，水浴锅(WNB45,MEMMERT)，灭菌器(SX-700，TOMY)，生物安全柜(1300 SERIES A2，Thermo),移液器(100～1000 μL,Eppendorf)，一次性移液管、玻璃试管、试管架、灭菌移液器吸头等。

1.2试剂

1.2.1补体结合抗原、溶血素、补体、阴阳性标准血清 补体结合抗原(批号：2020)，溶血素(批号：2019)，补体(批号：2019)，阳性标准血清(批号：202005))，阴性标准血清(批号：202005),上述试剂均购于青岛中创汇科。

1.2.2绵羊红细胞悬液 采取成年公绵羊血，按常规方法脱纤、洗涤、离心，用稀释液洗涤至上清无色为止，最后以2000 r/min离心定容。取红细胞用稀释液配制成2.5%红细胞悬液(2.5 mL/100 mL)备用。

1.2.3灭菌生理盐水 本实验室自制。

1.3检测样品 经cELISA试剂盒(批号18121701，购自中国兽医药品监察所)检测的43份牛羊血清，其中：牛阳性血清11份，羊阳性血清12份；牛阴性血清10份，羊阴性血清10份。

2 方法

按动物布鲁氏菌病诊断技术(GB/T18646-2018)补体结合试验常量法进行操作及判定[2]。

2.1溶血素效价测定 按表1加入各成分混匀后置37～38 ℃水浴20 min，从水浴中取出，立即判定结果。结果判定见表1，能使2.5%红细胞液完全溶血的最小量溶血素为溶血素效价或一单位溶血素，本次试验溶血素效价为3000倍稀释液500 μL，二单位溶血素的工作效价为1500倍稀释液500 μL。

表1 溶血素效价测定表(μL)

2.2补体效价测定 按表2加入各成分混匀后经2次37～38 ℃水浴20 min，最后一次水浴后立即判定结果。结果判定见表2，三个对照管及阳性血清加抗原的试管为完全不溶血，阳性血清未加抗原及阴性血清无论有无加抗原的试管发生完全溶血所需最小补体量，即为补体效价或一单位补体。本次试验补体效价为14倍稀释补体310 μL，计算得主试验原补体稀释倍数为22.58，补偿操作中效价降低，使用浓度比补体效价大10%，因此最终使用补体工作效价为20.32倍稀释原补体500 μL。

2.3溶血标准比色管制备 按表3配置溶血标准比色管，用于抗原效价测定及主试验结果的判定。

表2 补体效价测定(μL)

表3 补体结合试验溶血标准比色管制备(μL)

2.4抗原效价测定 将阴性对照血清作1∶10稀释，阳性血清稀释成1∶10，1∶25，1∶50，1∶75，1∶100，5个稀释度，分别按表4加入各种成分，经2次37～38 ℃水浴20 min，最后一次水浴后立即判定结果，观察记录各管溶血百分数。结果判定见表5，抗原对阴性血清应完全溶血，阳性血清各稀释度发生抑制溶血最强的抗原最高稀释度为抗原效价。本次试验抗原效价为1∶150，主试验使用抗原稀释度应比测定效价浓25%，最终抗原工作效价为1∶112.5。

表4 抗原效价测定(μL)

表5 抗原效价滴定结果

2.5主试验 对43份牛羊血清进行检测，试验设阴性血清、阳性血清、抗原、溶血素和补体对照，主试验各要素添加量和顺序见表6。具体操作如下：

(1)将1∶10稀释受检血清、阴阳性对照血清灭能，分别加入2支玻璃试管内，每管500 μL。其中一管加工作量抗原500 μL，另一管加稀释液500 μL。

(2)上述2管均加工作量补体，每管500 μL，震荡混匀。

(3)置37 ℃水浴20 min，取出放于室温环境中。每管各加2单位的溶血素500 μL和2.5%红细胞悬液500 μL。充分震荡混匀。

(4)再置37 ℃水浴20 min，取出立即进行第一次判定。

结果判定，以溶血标准比色管为参照，0～40%溶血判为阳性反应；50%～90%溶血判为可疑；100%溶血判为阴性反应。初判后静置12 h作第二次判定。

表6 补体结合试验主试验(μL)

3 结果与分析

3.1补体结合试验检测结果 通过上述补体结合试验方法检测43份牛羊血清，经两次判定后，试验结果见表7。

表7 补体结合试验结果

3.2补体结合试验与cELISA结果分析 以cELISA结果作为参照标准，采用四格表法分别对补体结合试验结果的Kappa一致性、敏感性、特异性、准确性进行比较分析(表8-9)[3]。本次试验两种检测方法结果一致性较差，Kappa值为0.3499，CFT特异性为70%，较敏感性(65.22%)及准确性(67.44%)稍高。

表8 补体结合试验与cELISA结果

表9 补体结合试验与cELISA比较

一致性：Kappa=[43×29-(21×23+22×20)]÷[43×43-(21×23+22×20)]≈0.3499

敏感性：M=15÷(15+8)×100%=65.22%

特异性：T=14÷(6+14)×100%=70.00%

准确性：Z=(15+14)÷43×100%=67.44%

4 讨论

我国现行标准中补体结合试验抗原系用我国自主知识产权的疫苗株布鲁氏菌S2株或S2和A99菌株，通常使用S2株[1]。在反刍类动物中，补体结合试验对接种牛种布鲁氏菌S19或A19、羊种布鲁氏菌RevI弱毒疫苗所产生的抗体相对不敏感，而对自然感染布鲁氏菌病的动物有很高的敏感性和特异性。在反刍类动物,主要的补体结合抗体为IgG1，IgG2不结合豚鼠补体而且能够阻止其他的免疫球蛋白结合补体而产生前带现象[1]。IgM可结合补体但其结合能力可因灭活血清时的加热而受到影响。在56 ℃灭活时几乎没有影响，而温度升高到65 ℃时，IgM结合补体的能力则被完全破坏[1]。

抗补体现象是补体结合试验中必须注意的问题。产生这种现象的原因较多，如血清中存在的某种脂类和变性的球蛋白能吸附大量的补体、血清存放时间太久或被细菌污染以及所用的玻璃试管等仪器不洁净均能导致抗补体现象的出现[4][5]。为防止产生抗补体现象，要求血清和所用的诊断抗原均不能被细菌所污染。采血后要立即分离血清，并及时操作或冰冻保存，所用的玻璃试管等器材必须十分清洁。

为了准确测定被检血清中的布病抗体，补体结合试验中除了被检血清，其他4种成分效价必须经过仔细测定，在主试验中处于平衡状态。补体量少导致不完全溶血，容易出现假阳性结果；反之，补体过量不能被第一反应系统的免疫复合物完全结合从而出现假阴性结果；溶血素量少，则溶血不完全，阴性血清被误判弱阳性；溶血素过量，则会延缓溶血时间；抗原过量会影响补体的结合；抗原不足不能完全结合补体等情况，最终都有可能导致假阳性或假阴性结果的出现[1，4]。每次进行补体结合试验前，各成分效价都要重新测定，操作繁琐，量化要求严格，这也就导致该方法难以普遍推广应用。