外源24-表油菜素内酯调控仔姜活性氧及酚类代谢减轻冷害

游玉明，汤 洁，张美霞，王大平，陆红佳

（1.经济植物生物技术重庆市重点实验室，重庆 402160；2.重庆文理学院园林与生命科学学院，重庆 402160）

生姜（Zingiber officinaleRoscoe）富含精油、姜辣素及维生素等营养物质，是世界范围内广泛食用的蔬菜和调味料之一。新鲜仔姜因姜香浓郁、脆嫩爽口、辛辣适宜而受到了消费者的青睐。然而仔姜外皮幼嫩、水分含量高、纤维素含量低，且采收后叶鞘及茎基部分受到机械损伤，常温贮藏5～7 d即发生失水萎蔫，受微生物浸染出现腐烂，从而失去商品价值[1-2]。低温能有效缓解仔姜的采后腐烂和变质，但其对低温敏感，当贮藏温度低于10 ℃时，即出现水渍状斑块，并发生硬度降低及褐变等冷害症状[3-4]，限制了低温贮藏技术在仔姜保鲜中的应用。因此，研究减轻仔姜冷害发生的控制措施对延长其保鲜期具有重要意义。

24-表油菜素内酯（24-epibrassionolide，EBR）是一种重要的甾醇类植物激素，具有高效安全的生物效应，不仅在植物的生长发育中发挥重要作用，且能提高植物在低温、盐、干旱及微生物浸染等生物或非生物胁迫下的抗逆性[5]。因此，EBR在果蔬采后病害的防控方面也有广泛的应用。EBR处理可提高猕猴桃[6]、蜜橘[7]、西兰花[8]等的贮藏品质和耐贮性，并通过提高抗病相关酶活性，增强葡萄的抗病性[9]。在果蔬采后冷害防控方面，Gao Hui等研究发现茄和桃果实分别采用10 μmol/L和15 μmol/L EBR浸泡10 min后，可显著抑制冷害的发生，维持细胞功能的完整性，抑制多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）及过氧化物酶等酚类代谢相关酶的活性，保持较高的酚类物质含量[10-11]。外源EBR处理也能通过调节杏果实的活性氧代谢（表现为•、H2O2的积累减少，保持较高的超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、抗坏血酸过氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）等活性氧代谢相关酶活性）从而显著降低果实冷害发病率和冷害指数[12]。Li Taotao等[13]研究则表明，40 μmol/L EBR处理可以增强香蕉果实的防御能力，促进能量的合成和利用，并通过促进蛋白质生物合成和抑制蛋白质降解来维持蛋白质功能，从而提高果实的耐冷性。但外源EBR处理对仔姜冷害的防控效果及可能机制还鲜见报道。本实验以鲜食生姜品种‘竹根姜’为实验材料，研究外源EBR处理对仔姜冷害的防控效果，并从活性氧及酚类代谢方面探讨其可能的作用机制，以期为外源EBR在仔姜保鲜中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜‘竹根姜’采自重庆市永川区五间镇生姜种植基地。选取成熟度一致、大小均匀、无病虫害的根茎作为供试材料。

EBR（纯度＞90%） 上海源叶生物科技有限公司；没食子酸标准品 美国Sigma公司；福林-酚北京索莱宝科技有限公司；茚三酮、磺基水杨酸、三氯乙酸、硫代巴比妥酸 国药集团化学试剂有限公司；其他均为国产分析纯试剂。

1.2 仪器与设备

752分光光度计 上海舜宇恒平科学仪器有限公司；S p e c t r a M a x M 4 酶标仪 美谷分子仪器（上海）有限公司；TA.XT plus质构仪 英国Stable Micro Systems公司；CM-5色差计 日本柯尼卡美能达公司；BS224S电子分析天平 德国赛多利斯公司；FE38电导率仪 梅特勒-托利多（上海）仪器有限公司；3-18K冷冻离心机 德国Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 样品处理

挑选好的‘竹根姜’根茎采用体积分数1%的次氯酸钠溶液消毒2 min，再以自来水洗净，室温自然沥干。将清洗消毒后的仔姜随机分成4 组，分别采用0（对照）、5、10 μmol/L及20 μmol/L的EBR溶液浸泡30 min，取出自然晾干后装入厚0.03 mm的聚乙烯袋，每袋5 个，置于4 ℃、相对湿度85%～90%的冷库中贮藏25 d。每个处理80 个仔姜，重复3 次。每5 d取10 个样品测定冷害指数，筛选出对仔姜冷害抑制的最佳浓度。

在筛选出最佳浓度的基础上，将仔姜随机分为对照组和处理组，按上述方法进行浸泡处理，贮藏25 d。每5 d定时取样测定相对电导率、丙二醛含量等变化。同时取仔姜根茎中部立即用液氮速冻，置于-80 ℃冰箱中，用于测定相关酶活力。

1.3.2 冷害指数的测定

冷害指数的测定参考Hao Jiashi等[14]的方法，并略作修改。根据仔姜根茎水渍状斑块面积大小分级：1级，无冷害发生；2级，冷害面积比例≤25%；3级，冷害面积比例25%～50%；4级，冷害面积比例50%～80%；5级，冷害面积比例≥80%。冷害指数按公式（1）计算。

1.3.3 硬度及色泽的测定

选取仔姜根茎中部，将其制备成均匀的姜块，采用质构仪测定其硬度，选用直径为5 mm探头，刺入速率为1.8 mm/s，压缩比为50%[15]。

色泽测定采用Chen Aiqiang等[16]的方法。选仔姜根茎中部附近表皮，测定其贮藏前的色泽（L0*、a0*、b0*值）和贮藏后的色泽（L*、a*、b*值），并按式（2）计算色差ΔE。

1.3.4 相对电导率及丙二醛含量的测定

相对电导率的测定参考凌晨等[17]的方法。用直径为10 mm的打孔器取样，称取厚约3 mm的薄片2 g，用滤纸吸出多余水分后放入具塞刻度试管中，加入20 mL去离子水，在室温下放置30 min，测电导率（κ1/（μS/cm））。然后煮沸15 min，冷却至室温后测电导率（κ2/（μS/cm））。相对电导率按公式（3）计算。

丙二醛含量的测定采用硫代巴比妥酸法[18]，分别测定上清液在450、532 nm和600 nm波长处的吸光度，含量单位为μmol/g，结果以鲜质量计。

1.3.5 H2O2含量的测定

H2O2含量的测定采用硫酸钛法[11]。称取5 g混匀后的样品，经预冷的丙酮充分研磨，在4 ℃、5 000×g条件下离心15 min，取上清液1 mL，加入0.1 mL 5 g/100 mL的硫酸钛和0.2 mL浓氨水反应后，再在4 ℃、5 000×g条件下离心10 min，沉淀经丙酮洗涤，最后在沉淀中加入3 mL 2 mol/L的浓硫酸溶液，于410 nm波长处测定其吸光度，单位为μmol/g，结果以鲜质量表示。

1.3.6 总酚含量的测定

总酚含量的测定参照高林等[19]的方法，具体采用Folin-Ciocalteu比色法。取2 g样品，加入6 mL无水甲醇，超声波提取，在4 ℃、10 000×g条件下离心10 min，取上清液定容至10 mL。取上述提取液0.4 mL，加入体积分数10%的Folin-Ciocalteu试剂2 mL，避光反应1 h，再加入1.8 mL 7.5 g/100 mL Na2CO3溶液，避光反应15 min，于765 nm波长处测定吸光度。结果以每克鲜样中含有的没食子酸质量表示，单位为mg/g。

1.3.7 相关酶活力的测定

SOD、CAT及APX活力测定采用曹建康等[20]的方法，并略作修改。称取5 g仔姜组织，加入5 mL预冷的50 mmol/L的磷酸钠缓冲液（pH 7.8，含1 mmol/L乙二胺四乙酸、5 g/100 mL聚乙烯吡咯烷酮），冰浴研磨匀浆后，于4 ℃、12 000×g离心30 min，收集上清液用于SOD、CAT和APX活力测定。SOD活力采用氮蓝四唑（nitro-blue tetrazolium，NBT）光化还原法，以每克鲜组织抑制NBT光还原反应50%为一个酶活力单位（U）；CAT和APX活力分别以每克鲜组织每分钟在240 nm和290 nm波长处吸光度变化0.01为一个酶活力单位（U）。

PPO和苯丙氨酸解氨酶（phenylalamine ammonia lyase，PAL）活力测定参考Kavitha等[21]的方法。分别以每克鲜组织每分钟在420 nm和290 nm处吸光度增加0.01为一个PPO和PAL活力单位（U）。

以上酶活力单位均为U/（g·min）

1.4 数据处理与分析

采用SPSS 21.0软件进行数据处理，通过Duncan’s法进行差异显著性分析，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著；利用Origin 8.1软件绘图。

2 结果与分析

2.1 EBR处理浓度的筛选结果

如图1A所示，各处理组仔姜的冷害指数随着冷藏时间的延长而不断增加，其冷害症状表现出时间累积效应，但不同浓度EBR处理对冷藏仔姜冷害指数的影响不同。其中采用10 μmol/L EBR处理的仔姜在整个冷藏期的同一监测点，其冷害指数均低于其他组。在冷藏至第5天时，仔姜表皮出现水渍状凹陷及黄褐色小斑点，并随着贮藏时间的延长逐渐扩大，冷藏15 d后，5、10 μmol/L和20 μmol/L EBR处理组仔姜的冷害指数分别为15.6%、9.4%和21.3%，对照组仔姜的冷害指数则达到了31.0%，显著高于各EBR处理组（P＜0.05），到冷藏结束时，各处理组间的表型差异最为明显（图1B），对照组仔姜的冷害指数仍显著高于各EBR处理组（P＜0.05），5、20 μmol/L EBR处理组仔姜的冷害指数分别为57.1%和69.2%，而10 μmol/L EBR处理组仔姜的冷害指数最低，仅为对照组的51.8%，说明EBR处理能显著缓解仔姜冷藏期间冷害的发生（P＜0.05），延长其保藏期，其处理的适宜处理浓度为10 μmol/L。因此，本实验选用浓度为10 μmol/L的EBR进一步探讨其缓解仔姜冷害的可能机制。

图1 EBR处理对仔姜冷害的影响Fig.1 Effect of EBR treatment on CI of baby ginger rhizome

2.2 EBR处理对仔姜硬度及色泽的影响

由图2A可知，随着冷藏时间的延长，处理组和对照组硬度不断降低，冷藏至第10天时，两者之间出现显著差异（P＜0.05），10 d后处理组的硬度均极显著高于对照组（P＜0.01），冷藏至25 d时，处理组硬度比对照组高38.6%。表明EBR处理可有效减缓仔姜冷藏期间硬度的下降，防止仔姜组织软化。

从图2B可看出，总色差ΔE随着冷藏时间的延长而不断增加，冷藏前10 d其上升速率较慢，而后快速增加。其中EBR处理组ΔE变化较小，冷藏至25 d时，仅为对照组的48.1%，两者之间达到了极显著差异（P＜0.01）。说明EBR处理能有效抑制仔姜冷藏过程中色泽的变化，从而较好地保持了仔姜色泽。

图2 EBR处理对仔姜硬度（A）及色泽（B）的影响Fig.2 Effect of EBR treatment on firmness (A) and color (B) of baby ginger rhizome

2.3 EBR处理对仔姜活性氧及酚类代谢的影响

2.3.1 EBR处理对仔姜相对电导率及丙二醛含量的影响

图3 EBR处理对仔姜相对电导率（A）及丙二醛含量（B）的影响Fig.3 Effect of EBR treatment on relative electric conductivity (A)and MDA content (B) in baby ginger rhizome

由图3A、B可以看出，在仔姜冷藏期间，相对电导率和丙二醛含量随着冷藏时间的延长而总体呈现上升趋势。EBR处理有效抑制了仔姜相对电导率及丙二醛含量的上升，冷藏至第10天时，EBR处理组丙二醛含量极显著低于对照组（P＜0.01），冷藏至25 d时，EBR处理组相对电导率及丙二醛含量分别比对照组低24.6%和10.5%（P＜0.05）。说明EBR处理能保护仔姜冷藏期间细胞膜的完整性，减轻低温胁迫对细胞膜的损伤，抑制膜脂过氧化产物丙二醛的积累。

2.3.2 EBR处理对仔姜H2O2含量及SOD、CAT、APX活力的影响

图4 EBR处理对仔姜H2O2含量（A）及SOD（B）、CAT（C）、APX（D）活力的影响Fig.4 Effect of EBR treatment on H2O2 content (A), SOD (B), CAT (C)and APX (D) activity in baby ginger rhizome

由图4A可知，仔姜在冷藏期间，H2O2含量不断增加。在整个冷藏过程中，EBR处理组H2O2含量始终低于对照组，冷藏至第25天时，EBR处理组H2O2含量比对照组低24.8%（P＜0.01）。

由图4B可知，仔姜在冷藏过程中，对照组和EBR处理组SOD活力均呈现上升趋势，但EBR处理组上升速率高于对照组，除冷藏第5、15天外，EBR处理组SOD活力均显著高于对照组，冷藏至25 d时，EBR处理组SOD活力为2.90 U/（g·min），比对照组高9.0%（P＜0.01）。可见，EBR处理提高了冷藏期间仔姜的SOD活力。

由图4C可知，仔姜在冷藏过程中，其CAT活力呈现先上升后下降的趋势，对照组仔姜的CAT活力在冷藏至5 d时出现了峰值（56.73 U/（g·min）），随后开始下降，在冷藏至25 d时，CAT活力下降至28.11 U/（g·min）；EBR处理组也在冷藏至5 d时达到峰值（63.11 U/（g·min）），其峰值比对照组仔姜高11.2%，冷藏至25 d时，其CAT活力为38.14 U/（g·min），比对照组高35.7%（P＜0.01）。说明EBR处理减缓了仔姜冷藏期间CAT活力的下降。

由图4D可见，仔姜在冷藏过程中，其APX活力的变化趋势与CAT活力的变化趋势基本一致。但在冷藏至第10天时，EBR处理组和对照组的APX活力均达到峰值，其中对照组为76.92 U/（g·min），EBR处理组为82.15 U/（g·min），比对照组高6.8%，随后开始下降，冷藏至25 d时，EBR处理组APX活力为61.72 U/（g·min），比对照组高33.2%（P＜0.01）。说明EBR处理提高了仔姜冷藏期间APX的活力。

2.3.3 EBR处理对仔姜总酚含量及PAL、PPO活力的影响

图5 EBR处理对仔姜总酚含量（A）和PAL（B）、PPO（C）活力的影响Fig.5 Effect of EBR treatment on total phenol content (A), and PAL (B)and PPO (C) activity in baby ginger rhizome

由图5A可知，仔姜在冷藏过程中，总酚含量呈先升高后降低的趋势，且在冷藏至第5天时EBR处理组和对照组均出现峰值，其中对照组总酚含量为0.20 mg/g，EBR处理组则为0.23 mg/g，比对照组高15.0%，冷藏至25 d时，EBR处理组总酚含量为0.18 mg/g，比对照组高38.5%（P＜0.01），与对照组第10天时总酚含量相当。由此可见，EBR处理可以维持仔姜冷藏过程中较高的酚类物质含量。

由图5B可知，仔姜冷藏期间，对照组及EBR处理组PAL活力总体呈现上升趋势。与对照组相比，EBR处理提高了仔姜PAL的活力，冷藏至25 d时，EBR处理组PAL的活力为55.47 U/（g·min），比对照组高24.8%（P＜0.01）。说明EBR处理可有效激活PAL活力，促进酚类物质的合成。

由图5C可知，仔姜冷藏期间，其PPO活力的变化趋势与PAL活力的变化趋势基本一致。但EBR处理抑制了仔姜PPO的活力，尤其是在冷藏后期，两者之间达到极显著差异（P＜0.01），冷藏至25 d时，EBR处理组PPO活力为3.01 U/（g·min），比对照组低17.3%（P＜0.01）。可见，EBR处理可明显抑制PPO活力，缓解酚类物质氧化。

2.4 相关性分析结果

表1 仔姜冷害指数与主要生理品质指标间的皮尔逊相关性分析Table 1 Pearson correlation analysis between CI and main physiological indicators of baby ginger rhizome

从表1可以看出，冷害指数与相对电导率、丙二醛含量和H2O2含量、SOD活力呈极显著正相关（r分别为0.890、0.788、0.958、0.787，P＜0.01），与CAT和APX活力呈显著负相关（P＜0.05），说明随着冷害症状的发生，仔姜细胞膜的完整性被破坏，膜通透性增加，膜脂过氧化物丙二醛、H2O2的积累增多，从而激发SOD活力的增加，但会引起CAT和APX活力的降低。冷害指数与总酚含量呈负相关，但两者间的相关性不显著（P＞0.05），这可能是随着冷害的发生，植物组织产生防御反应，激发了PAL活力的上升，促进了酚类的合成，但细胞间区室化被破坏，PPO游离出来，导致了酚类物质的大量消耗，从而引起褐变，表现为ΔE与冷害指数之间呈极显著正相关（P＜0.01）。

3 讨 论

仔姜在低温下极易发生冷害现象，随着冷害的发生，其色泽和硬度产生相应变化，表现为冷害指数与硬度呈极显著负相关（r＝-0.897），而与ΔE呈极显著正相关（r＝0.918），这严重影响了其货架期和品质。本实验结果表明，外源EBR处理缓解了仔姜冷害的发生，显著降低了仔姜的冷害指数，保持了良好的色泽及硬度，其中以10 μmol/L EBR处理效果最为明显。

研究表明，活性氧代谢失衡是导致植物在低温胁迫下发生冷害的主要原因之一[22-23]。在正常状态下，植物细胞内活性氧的生成和清除处于动态平衡，当植物受到低温胁迫时，这种平衡遭到破坏，导致大量活性氧自由基产生，使机体处于氧化应激状态，进而启动细胞膜的脂质过氧化作用，破坏细胞膜的完整性，使过氧化产物丙二醛积累，电解质外渗，最终导致果蔬品质劣变[24]。本实验结果也表明，随着冷害的产生，仔姜H2O2及丙二醛的含量不断增加，细胞膜透性增强，相对电导率逐渐上升，三者与冷害指数之间均表现为极显著正相关。因此，通过适当的采后处理调节果蔬在低温胁迫下的活性氧代谢失衡，是提高果蔬抗冷性、延长其货架期的有效手段之一。研究表明，多种外源化学成分或物理方式处理可通过调节果蔬活性氧代谢来达到延长果蔬货架期的目的。如赤霉素[25]和精氨酸[26]等化学保鲜剂可分别通过抑制香椿和石榴冷藏过程中丙二醛及H2O2含量的上升，减少膜脂过氧化作用，增强其抗冷性，减轻冷害症状。冷激及热处理等物理方式也可通过改善冷藏过程中茄子[27]、哈密瓜[28]等活性氧代谢紊乱，从而减轻果蔬的冷害。Yao Yaming等[29]研究表明，黄花菜经0.5 mg/L EBR处理可显著减少•和H2O2的积累，维持细胞膜的完整性，从而延缓其衰老进程，保持较好的贮藏品质。本研究也发现，采用EBR处理显著降低了仔姜在冷藏过程丙二醛及H2O2的含量，抑制其细胞内电解质的外渗，保持了细胞的完整性。为清除产生的过量活性氧自由基，植物体内拥有复杂而完善的抗氧化防御系统，其中SOD、CAT及APX等主要酶类在活性氧清除系统中发挥了重要作用，SOD可催化•歧化生产H2O2，生成的H2O2再被CAT、APX分解成无毒的H2O和O2，它们之间的相互协同以减轻活性氧自由基对细胞膜的伤害，从而抑制活性氧自由基诱导的氧化应激[30]。本研究发现，冷害诱导了仔姜SOD、CAT及APX活力的改变，其冷害指数与SOD、CAT及APX活力均显著相关，而EBR处理有效提高了仔姜SOD、CAT及APX活力。Wang Xiaolu等[6]研究也表明，EBR处理可通过上调猕猴桃SOD及APX等抗氧化酶活力，减小氧化损伤。以上结果说明，激活仔姜活性氧代谢相关酶活力，减少机体活力氧自由基的积累，可能是EBR提高其耐冷力的潜在机理之一。

酚类物质作为植物体内的重要次生代谢产物，它不仅是植物体内重要的非酶抗氧化剂，还是酶促褐变反应的必要底物。很多冷敏性果蔬在低温胁迫下都伴随着酚类物质含量的增加，而适当的采后处理可以通过积累更多的酚类物质，减小氧化损伤，从而缓解果蔬冷害症状[31-32]。酚类物质的代谢与PAL和PPO等酶密切相关，PAL是酚类生物合成的关键酶和限速酶，可催化苯丙氨酸脱氨转化成肉桂酸；PPO作为植物体内广泛存在的酶类，在有氧的情况下将酚类物质催化转变成红褐色，再与氨基酸缩合生成黑褐色物质[33]。正常状态下，酚类物质与这些酶的区域化分布抑制了酶促褐变，但在低温胁迫下植物细胞膜透性增加，细胞区域化逐渐丧失，使得酚类物质与酶接触，最终导致酚类物质的减少，组织褐变[34]。本实验研究显示，冷害导致了仔姜PAL和PPO活力的上升，表现为冷害指数与PAL和PPO活力呈极显著正相关，而EBR处理后仔姜PAL活力增加，促进了酚类物质的合成；同时，显著抑制了PPO的活力，减少了酚类物质的消耗。说明EBR可通过调节酚类物质代谢相关酶类，保持较高的酚类物质含量，从而减轻仔姜冷害症状。但Gao Hui等[35]研究则表明，EBR处理抑制了藕片PAL的活性，其对酚类物质的累积则主要通过抑制PPO的活性实现，这可能与样品及贮藏方式的不同有关[35]。

综上所述，10 μmol/L的外源EBR处理能有效缓解仔姜低温贮藏期间的冷害发生，并抑制了H2O2和丙二醛的积累，维持膜结构的完整性，其机制可能与调节活性氧和酚类代谢相关酶活性、维持较强的抗氧化能力，进而减轻氧化损伤有关。