啤酒花浸膏对壳聚糖/聚乙烯双层膜的性能影响及释放行为

陈凤霞，曹 军，刘玉梅

（新疆大学化学学院，煤炭清洁转化与化工过程自治区重点实验室，新疆 乌鲁木齐 830046）

活性包装是一种创新型包装，由于其与包装材料、食品和环境的相互作用，可有效延长食品的货架寿命，更好地保护口味，在降低防腐剂等食品添加剂用量的同时，又能保持产品的品质，因而备受人们的关注[1]。这种延长保质期的方法是通过在包装材料的内部或表面添加抗菌剂或抗氧化剂等活性物质，进而通过材料持续扩散释放到食品表面以抑制微生物生长，减缓微生物生长速度或者减少其成活数量，同时阻隔外部环境对食品的不良作用，从而起到保持产品品质和延长保质期的作用[2]。

添加到包装材料内的抗菌成分主要为合成抗菌剂（包括无机抗菌剂、有机化学抗菌剂）和天然生物抗菌剂[3]。由于合成抗菌剂的毒性和潜在的致癌作用，在食品包装中添加天然抗菌剂已成为一种趋势[4-7]。啤酒花浸膏是啤酒花通过二氧化碳经超临界萃取得到的天然活性物质，主要包含啤酒花苦味树脂和精油等化学成分，通常用于啤酒酿造，提供啤酒所需的苦味以及防腐作用[8]。作为食品添加剂和食品包装材料时同样具有良好的抗氧化及抑菌效果[9]。

聚乙烯（polyethylene，PE）薄膜由于无毒、无味、无臭、符合食品包装卫生标准且价格低廉，常用作食品保鲜。作为食品包装材料，PE具有机械性能良好、低润湿性和高防潮性等优势[10]，但是缺乏活性功能。研究者们常直接将精油、迷迭香、儿茶素、没食子酸等天然活性物质加入PE中制备活性包装[11-12]。然而活性物质释放不理想，因为在处理PE时通常处于高温条件，会导致活性物质的降解。此外，如将活性物质接枝于PE表面，由于它们之间强烈的化学键合会导致活性物质难以释放到食品表面[13]。因此，可将这些化合物依附另一个载体，然后进一步层压在PE表面上产生双层膜。壳聚糖是一种从甲壳素中提取的生物高分子材料，以其独特的高分子结构、生物相容性、生物降解性等内在功能特性引起了科学界和工业界的广泛关注。壳聚糖及其衍生物常用于食品工业、农业、制药、医药、美容、纺织和造纸工业以及化学等领域[14-16]。在食品包装方面，因其价格低廉、安全无毒、良好的成模性和较强的抗菌防腐能力，常与各种天然抗氧化剂和抑菌剂结合用于延长食品货架期[17-19]，但壳聚糖具有较高的水蒸气透过性，易导致食品失水。因而有学者将壳聚糖与PE膜结合添加活性成分制备双层膜用于食品的保鲜研究[20]，但对膜的基本理化性能及活性物质的释放行为研究较少。

本研究将壳聚糖作为载体添加啤酒花浸膏铺覆于PE表面，目的是开发一种基于啤酒花浸膏的壳聚糖/PE双层抑菌膜的活性包装。并通过研究薄膜的微观结构、物理特性、抗菌性能以及啤酒花浸膏在抑菌膜中的释放规律，为食品包装的开发提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 菌种、材料与试剂

大肠杆菌、肺炎杆菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、蜡样芽孢杆菌均保存于新疆维吾尔自治区食品药品检验所。

LB培养基 北京奥博星生物技术有限公司；壳聚糖（脱乙酰度＞90%） 上海蓝极科技发展有限公司；超临界CO2萃取的啤酒花浸膏（α-酸50.82%、β-酸12.87%） 新疆三宝乐农业科技有限公司；PE膜浙江清清美家居用品有限公司；甘油（质量分数≥98%）、乙酸、无水乙醇 天津致远化学试剂有限公司；其他常用试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

BS210S型电子天平 德国赛多利斯公司；DF-II集热式磁力加热搅拌 金坛市医疗仪器厂；DPH-420型电热恒培养箱 北京市永光明仪器有限公司；HP-200精密色差仪 东莞市国产精密色差仪厂；UV-5300PC型紫外-可见分光光度计 上海元析仪器有限公司；SU8000场发射扫描电子显微镜（scanning electron micrroscope，SEM） 日本Hitachi公司；自制成膜器（17 cm×7.5 cm）。

1.3 方法

1.3.1 壳聚糖/PE双层抑菌膜的制备

参考前期研究[21]，取2 g壳聚糖溶于90 mL体积分数2%乙酸溶液，70 ℃持续搅拌至完全溶解，冷却至30 ℃，将1 g甘油溶于5 mL蒸馏水中，缓慢加入壳聚糖溶液，搅拌1 h，再分别加入0、0.1、0.2、0.3 g的啤酒花浸膏（5 mL无水乙醇溶解），使啤酒花浸膏终质量浓度分别为0（对照）、0.1、0.2、0.3 g/100 mL，搅拌1 h，静置脱气约12 h，再超声脱气2 h，制得的成膜液用延流法铺于贴有PE膜的自制成膜器中，在37 ℃恒温培养箱中干燥20 h，制备得到壳聚糖/PE双层抑菌膜。

1.3.2 膜厚度的测定

每个薄膜随机选取10 个点用游标卡尺测量，测量精度为±0.001 mm。

1.3.3 色泽、透光率和不透明度的测定

薄膜色泽的测定根据Dou Lixue等[22]的方法，将色差仪用标准的黑白板校准后对每个薄膜样品至少测定3 次，薄膜的色泽分别用L*值（亮度）、a*值（红/绿）和b*值（黄/蓝）表示。利用紫外-可见分光光度计记录薄膜200～800 nm波长处在空气中的透光率。薄膜的不透明度按式（1）计算。

式中：d表示膜的厚度/mm。

1.3.4 水分质量分数和溶解度的测定

将膜裁成1 cm×1 cm的膜片，用分析天平准确称质量，记为m0/g，放置在表面皿中，在105 ℃烘箱中烘干至恒质量，用分析天平准确称质量，记为m1/g。将完全烘干后的膜片放入50 mL蒸馏水中，在室温下浸泡24 h，再放置在烘箱中105 ℃烘干至恒质量，用分析天平准确称质量，记为m2/g。水分质量分数和溶解度分别按公式（2）、（3）计算。

1.3.5 微观结构的观察

利用SEM观察薄膜的表面微观结构。在观察之前，按照仪器说明对样品进行前处理并粘附于导电胶上喷金处理。

1.3.6 抑菌活性的测定

根据琼脂扩散实验法[2]评价双层抑菌膜的抑菌活性，通过固体培养基上的抑菌区确定薄膜抗微生物的效果。测试菌包括单增生李斯特菌、蜡样芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和肺炎杆菌。取上述5 种菌株加入到无菌的营养琼脂中，37 ℃下活化24 h，挑取活化后的菌落于质量分数0.85%生理盐水中，调节浊度至0.50麦氏浊度单位，使菌的浓度为1.5×108CFU/mL。取0.1 mL菌悬液于100 mL LB培养基中混匀，倒入直径为9 cm无菌培养皿，将膜片裁成直径为6 mm的圆片，贴附于培养基表面，37 ℃下培养24 h，测量抑菌圈直径。

1.3.7 膜中啤酒花浸膏的释放行为测定

依据欧盟委员会指令（EU 10/2011）[23]，定义食品模拟物如下：水，模拟物水性食品；3%（体积分数，下同）乙酸，模拟酸性（pH值＜4.5）食品；10%乙醇，模拟酒精类食品；95%乙醇和异辛烷，模拟高脂肪食品；50%乙醇，模拟高脂肪食品含酒精的产品、牛奶和一些乳制品。本研究中因啤酒花浸膏具有疏水性，既选择在10%、50%、95%的乙醇模拟体系下进行释放。

取膜片（3 cm×5 cm）置于100 mL具塞式锥形瓶中，分别加入体积分数为10%、50%、95%的乙醇溶液50 mL，放入恒温水浴锅中，以4、25、35 ℃作为迁移温度，释放一定时间，取1 mL释放液按一定比例稀释，测定其在326 nm波长处的吸光度，根据啤酒花浸膏的标准曲线，计算模拟液中啤酒花浸膏的质量，即为膜片中的释放量。按公式（4）、（5）分别计算膜片中啤酒花浸膏释放量及释放率。

1.4 数据统计分析

所有数据均至少平行测定3 次。使用SPSS 20.0软件进行数据分析，结果以平均值±标准偏差表示，利用单因素方差分析中的邓肯氏法进行显著性分析，P＜0.05表示差异显著，采用Origin 8.6软件作图。

2 结果与分析

2.1 含啤酒花浸膏的壳聚糖/PE双层抑菌膜的物理特性

表1 含啤酒花浸膏的壳聚糖/PE双层抑菌膜的物理性能Table 1 Physical properties of chitosan-coated antibacterial PE bilayer films

薄膜的厚度是至关重要的参数，因其会影响食品包装的其他性能，如水蒸气和气体的渗透性、活性化合物的扩散，以及对昆虫和微生物攻击的防护。由表1可知，随着啤酒花浸膏添加量在0～0.2 g/100 mL范围内的增加，膜的厚度变化不显著；添加量增至0.3 g/100 mL后，厚度显著增加，这主要是因为啤酒花浸膏添加量较大导致薄膜表面粗糙程度增加，从而使厚度增加。这与Atef等[24]的结果相似。

啤酒花浸膏的加入改变了壳聚糖/PE膜水亲和能力，随着啤酒花浸膏添加量的增加，溶解度和水分质量分数逐渐降低，与Wang Liyan等[25]将淡竹叶提取物添加到壳聚糖中的结果一致。水亲和能力的改变是由于啤酒花浸膏中含有大量的α-酸和β-酸，它们的羟基与壳聚糖的氨基之间存在很强的相互作用，使水分子与壳聚糖链上的氨基链接受阻。

2.2 含啤酒花浸膏的壳聚糖/PE双层抑菌膜的色泽

薄膜的色泽影响包装外观和消费者接受度。如表2所示，与对照组相比，添加啤酒花浸膏显著降低了膜的L*值，同时显著提高了a*值和b*值，与壳聚糖中添加苹果多酚后色泽的变化趋势[26]相同。然而酒花浸膏添加量从0.1 g/100 mL增加到0.2 g/100 mL时，L*、a*值没有显著改变（P＞0.05），但增加到0.3 g/100 mL时两者均显著降低。此现象是由于啤酒花浸膏含量较高时在膜液中发生聚集，导致明亮度急剧下降。根据所测的色泽及观察结果可知，含啤酒花浸膏的膜的色泽比对照膜略深，且色泽略偏黄。

表2 含啤酒花浸膏的壳聚糖/PE双层抑菌膜的色泽Table 2 Color of chitosan-coated antibacterial PE bilayer films

图1 含啤酒花浸膏的壳聚糖/PE双层抑菌膜的透光率Fig.1 Light transmittance of chitosan-coated antibacterial PE bilayer films

薄膜应用于食品表面时，薄膜的透光性和透明度也是一个非常重要的考察标准。由图1 可知，在200～800 nm范围内，随着啤酒花浸膏添加量的增大，透光率呈下降趋势。在200～380 nm范围内添加啤酒花浸膏的膜透光率基本为零，说明该膜相较对照膜更有利于防止紫外线的透过。此外，啤酒花浸膏使壳聚糖/PE膜的不透明度显著增加（P＜0.05）（表2），说明加入啤酒花浸膏可以改善壳聚糖/PE膜的光阻隔性能，防止食品发生氧化变质。因此，啤酒花浸膏壳聚糖/PE膜更适合用于紫外线敏感的食品包装。

2.3 含啤酒花浸膏的壳聚糖/PE双层抑菌膜的微观结构

图2 含啤酒花浸膏的壳聚糖/PE双层抑菌膜的SEM图Fig.2 Scanning electron microscopic image of chitosan-coated antibacterial PE bilayer films

利用SEM可观察到成膜基质微观结构的相关信息，可有效解释成膜基质的厚度、力学性能、透气性等宏观性能的变化原因。由图2可知，壳聚糖/PE膜表面可观察到一些颗粒，这可能是由于成膜液黏度较高造成壳聚糖聚集形成晶粒。但薄膜的表面呈现均匀、光滑、连续的结构，表明壳聚糖具有高度相容性和良好的成膜特性，此结果与de Moraes Crizel等[17]的结果相似。相较于对照膜，添加0.3 g/100 mL啤酒花浸膏的膜出现了相分离情况，使膜表面粗糙且凹凸不平，这种现象可能是由于啤酒花浸膏的结构特性使其不溶于水，在有机溶剂中溶解性更好，从而不能轻易地进入聚合物链。因此，可以观察到因相分离而导致出现了膜表面粗糙、杂乱无章的现象，类似的结果在文献[27]中也有报道。这也进一步佐证了0.3 g/100 mL啤酒花浸膏的膜厚度相较其他膜偏大。

2.4 含啤酒花浸膏的壳聚糖/PE双层抑菌膜的抑菌活性

表3 含啤酒花浸膏的壳聚糖/PE双层抑菌膜的抑菌活性Table 3 Antibacterial activity of chitosan-coated PE bilayer films incorporated with hops extract

通过琼脂扩散法评价不同添加量啤酒花浸膏抑菌膜对革兰氏阴性菌（大肠杆菌、肺炎杆菌）和革兰氏阳性菌（蜡样芽孢杆菌、单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌）的抑菌活性。由表3可知，壳聚糖/PE膜对5 株菌均没有抑菌效果，这与壳聚糖的广谱抑菌性相反，主要由于增塑剂使壳聚糖分子在膜内的固定化影响了壳聚糖抑菌活性的释放，导致其抑菌活性下降，此现象与Genskowsky等[28]的结果相似。而添加啤酒花浸膏的膜都显示出了良好的抑菌活性，并随着啤酒花浸膏的添加量增加，抑菌圈直径也逐渐增加。这主要因为啤酒花浸膏中α-酸、β-酸以及啤酒花精油都具有良好的抑菌活性，通过作用于细菌的细胞膜，使细胞膜发生不同程度的皱缩破裂，导致细胞内核酸流出而抑制了细菌生长[29]。此外，啤酒花浸膏对革兰氏阳性菌敏感程度强于革兰氏阴性菌，可能是由于其亲脂性较强，革兰氏阴性菌的细胞壁脂多糖会阻止其中的活性成分从细胞质膜渗透[30-31]。

2.5 食品模拟液中酒花浸膏的释放行为

在目前的研究中，活性包装膜的释放取决于不同的因素，如液体向膜基质的迁移、聚合物的溶解度、活性化合物通过膜基质向食品模拟液体的扩散以及由活性化合物与生物基质之间的特定相互作用等不同因素作用[32]。本实验研究了啤酒花浸膏在3 种不同的食物模拟物（10%、50%、95%乙醇）体系中的释放规律。图3显示了含啤酒花浸膏的壳聚糖/PE双层膜在上述3 种食品模拟物中4、25、35 ℃环境下的啤酒花浸膏不同时刻的释放量。为了更好地解释不同添加量啤酒花浸膏的释放行为，继续研究了特定时间内活性成分（啤酒花浸膏）释放率的变化，具体结果见图4。

图3 壳聚糖/PE双层抑菌膜中啤酒花浸膏在模拟体系中的释放量Fig.3 Release amount of hops extract from chitosan-coated PE bilayer films in simulated food systems

由图3可知，在所有的测试模拟体系中均观察到相似的释放曲线，释放过程都是由快速释放到缓慢释放然后进入释放平衡阶段，但是不同食品模拟体系达到最大释放量和释放率的时间有所不同。随着温度的升高，啤酒花释放量逐渐增大，且到达平衡所需时间越短。因为随着温度的升高，分子扩散加剧，分子间排斥力增大，导致啤酒花浸膏和壳聚糖作用力降低，因此加速了啤酒花浸膏的释放[33]。随着模拟液中乙醇体积分数的增加，模拟液中啤酒花浸膏的释放量增加，由于95%乙醇与啤酒花浸膏具有相似的疏水性，因此它的快速、高释放水平是可以预期的，这与陈婷等[34]在明胶/壳聚糖膜液中添加啤酒花浸膏的结果相同。

图4 壳聚糖/PE双层抑菌膜中啤酒花浸膏在模拟体系中的释放率Fig.4 Release percentage of hops extract from chitosan-coated antibacterial PE bilayer films in simulated food systems

由图4可知，随着啤酒花浸膏添加量的增加，其在模拟体系中的释放率增加，且释放平衡所需时间缩短，由于不同添加量啤酒花浸膏在壳聚糖基体中的参与程度不同，导致在聚合物链中向模拟物的迁移速率不同，随着啤酒花浸膏添加量的增加，在成膜液中会发生聚集形成较大的晶体，导致在膜液中分散不均匀，减少了与聚合物分子间的交联；而添加量较低时分散更加均匀，更容易与壳聚糖发生相互作用[2]。此外，在不同温度、不同模拟物中啤酒花浸膏的释放率均小于100%，且0.1、0.2、0.3 g/100 mL啤酒花浸膏添加量薄膜在35 ℃ 95%乙醇体系下的释放率最大，最大释放率分别为72.94%、82.60%、94.32%，而在4 ℃ 95%乙醇体系中，该值则依次为65.65%、76.62%、83.71%。结果表明含啤酒花浸膏的壳聚糖/PE双层抑菌膜更加适用于高脂类食品的包装。

3 结 论

本实验成功制备了一种含啤酒花浸膏的壳聚糖/PE双层抑菌膜。啤酒花浸膏的加入使薄膜表面更加粗糙，厚度增加，色泽加深、趋于黄色，同时对紫外-可见光具有优异的屏障活性且综合各项性能发现，含0.2 g/100 mL啤酒花浸膏的双层膜性能最佳。在不同时刻、不同温度下，不同添加量啤酒花浸膏在食品模拟物体系（10%、50%、95%乙醇）中的迁移规律表明，模拟液中乙醇体积分数越高，啤酒花浸膏释放量越高，且随着温度升高，释放量递增，释放平衡时间缩短；在不同添加量下，啤酒花浸膏含量越高，释放量也越高；因此，含啤酒花浸膏的壳聚糖/PE双层抑菌膜更适用于高脂体系食品的包装。与传统单层包装膜（塑料包装、可食性包装）相比，壳聚糖/PE的双层包装既可避免塑料包装直接接触食品而可能产生的塑化剂及聚合物单体向食品迁移所引起的潜在风险，又可以弥补壳聚糖阻水能力差的性能，同时啤酒花浸膏高效安全的抑菌活性还使其具备了新的包装性能。因此，壳聚糖/PE双层抑菌膜的制备可为其开发提供理论参考。