低氧/低氧诱导因子-1α通过TGF-β1诱导人肝内胆管上皮细胞上皮间质转化

杨再兴，梁艳，刘东红，张振成，罗婉婉，毛盼璎

1.台州市第一人民医院 检验科，浙江 台州 318020；2.上海长征医院 实验诊断科，上海 200003

原发性胆汁性胆管炎（primary biliary cholangitis，PBC）是一种以肝内胆管上皮细胞（intrahepatic biliary epithelial，IBEC）炎症性损伤为主要表现的慢性自身免疫性胆汁淤积性肝病，最终会缓慢进展为肝硬化、肝癌。PBC病因不 清，早期症状隐匿，患者出现症状至医院就诊时往往已出现明显肝纤维化甚至肝硬化，但PBC由炎症向纤维化发展的机制至今尚未完全阐明。本实验室和其他国内外研究均发现，PBC患者的IBEC存在上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition， EMT）现象，这种转化可能是PBC由炎症向纤维化过渡的一个重要机制[1-3]。

低氧是公认的各种肝纤维化疾病肝组织中广泛存在的现象，在PBC患者肝组织门管区也存在低氧情况[4]，但低氧是否与IBEC发生EMT有关，国内外尚未见相关研究报道。因此，本研究拟深入探讨低氧是否可以诱导人IBEC（human IBEC，HIBEC）发生EMT，并阐释其可能分子机制。

1 材料和方法

1.1 细胞及主要试剂、耗材 HIBEC购自北京北纳创联生物技术研究院；1640培养基、胎牛血清和胰蛋白酶购自美国Gibco公司；10 cm细胞培养皿和6孔细胞培养板购自美国Fisher Scientific公司；TGF-β1 ELISA检测试剂盒购自武汉优尔生公司；高纯总RNA快速提取试剂盒购自上海捷瑞生物工程有限公司；反转录试剂盒HiScript-II Q RT SuperMix、 ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix和Exfect®2000 转染试剂购自南京诺唯赞生物科技公司；CFX connect Real-Time PCR System定量PCR仪及其配套使用分析软件为美国Bio-Rad公司产品；polycarbonate membranes chambers为美国Corning公司产品；TGF-β1抑制剂（LY364947）购自美国Selleck公司；E-钙黏蛋白（E-cadherin）、低氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）、S100A4抗体购自美国Abcam公司；GAPDH抗体、羊抗兔和羊抗鼠二抗购自杭州联科生物技术公司；PVDF膜为美国Millipore 公司产品；Tris和甘氨酸购自美国Amresco公司；过硫酸铵（ammonium persulfate，AP）和四甲基乙二胺（N，N，N’，N’-Tetramethylethylenediamine，TEMED）购自美国Sigma公司；ECL Plus发光试剂盒、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（5×）、免疫印迹用细胞裂解液、苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）、BCA蛋白浓度测定试剂盒均购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.2 主要仪器 3111型CO2培养箱为美国Thermo公司产品；倒置显微镜购自日本Olympus公司；台式高速冷冻离心机为湖南湘仪实验仪器开发有限公司产品；台式低速离心机为湖南凯达实业发展有限公司产品；Mini-Proten Tetra System电泳系统和ChemiDoc XRS+System凝胶成像仪购自美国Bio-Rad公司；Merinton SMA4000高精度分光光度计购自北京美林恒通科技有限公司；微量加样器购自德国Eppendorf公司；SpectraMax Plus 384型全波长酶标仪为美国MD公司产品。

1.3 HIF-1α siRNA设计合成 共设计合成3条HIF-1α siRNA，由广州锐博生物科技有限公司完成，靶序列分别为，1#：CATGAGGAAATGAGAGAAA；2#：GATGG AAGCACTAGACAAA；3#：CCTCAGTGTGGGTATAAGA。1.4 方法 HIBEC细胞培养在含10% FBS的RPMI- 1640培养基中，37 ℃、5% CO2、饱和湿度培养， 0.25%胰蛋白酶消化传代。取对数生长期的细胞，以每孔2×105的浓度，接种6孔板，培养过夜待细胞贴壁后，并列进行后续实验。

1.4.1 PCR实验：利用Exfect®2000 转染试剂转染HIF-1α siRNA，以转染空载体作为阴性对照（NC），24 h后，提取总RNA，行定量PCR实验。

1.4.2 细胞分组：常氧组，常氧培养72 h；低氧组，常氧培养48 h后，低氧培养24 h；NC组，转染空载体后常氧72 h；NC+低氧组，转染空载体后常氧48 h，低氧培养24 h；siRNA组：转染HIF-1α siRNA后常氧培养72 h；siRNA+低氧组，转染HIF-1α siRNA后常氧培养48 h后，低氧培养24 h；低氧+LY364947组，常氧培养48 h后，加入终浓度5 μg/mL的LY364947并低氧培养24 h。上述的低氧是指氧浓度1%。

1.4.3 划痕实验：以最后24 h的开始记为0 h，划痕后立即40倍拍照，继续培养至24 h，再次40倍拍照，测量计算各组细胞愈合率来反映细胞迁移情况，计算方法如下：细胞迁移率=（1-24 h后刮痕面积/0 h刮痕面积）×100%。

1.4.4 侵袭实验：待转染48 h收集各组细胞，用含2% FBS的RPMI1640培养基重悬，以5×104的密度接种24孔板Transwell小室的上室，下室加入500 μL 的含10% FBS的RPMI 1640培养基，再分别进行常氧或低氧培养24 h，经4%多聚甲醛室温固定后，棉签擦去小室膜上层细胞，经结晶紫染色，200倍拍照，记数穿膜细胞数。

1.4.5 TGF-β1含量检测：分别收集各组细胞和培养基上清液，参照试剂盒说明书进行ELSIA法检测。1.4.6 HIF-1α、E-cadherin、S100A4蛋白及HIF-1α mRNA检测：分别收集相应组别细胞，提取总蛋白，免疫印迹检测HIF-1α、E-cadherin、S100A4蛋白表达；提取RNA，反转录后进行定量PCR，反应条件为95 ℃ 30 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，重复40 个循环，熔解曲线70～95 ℃；2-ΔΔCt分析HIF-1α基因的mRNA变化。引物信息见表1。

表1 HIF-1α和β-actin的引物信息

1.5 统计学处理方法 所有数据采用SPSS13.0进行统计。计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HIF-1α siRNA的干扰效果 实验结果显示3条HIF-1α的siRNA对HIF-1α的mRNA和蛋白的表达水平均有明显抑制作用，且3#效果最优，故后续实验均采用3#进行HIF-1α基因沉默。见图1。

2.2 低氧通过HIF-1α诱导HIBEC发生EMT 为排除转染本身对结果的可能干扰，本实验中所有未转染HIF-1α siRNA的研究组均转染了空载体作为NC。结果显示，1%氧浓度的低氧培养24 h后，HIF-1α表达明显升高，HIF-1α siRNA可以明显抑制HIF-1α的表达；低氧可以诱导E-cadherin表达明显降低，S100A4 明显升高，应用siRNA抑制HIF-1α后，则有明显逆转（见图2）。划痕实验显示，低氧培养后，HIBEC迁移率明显增加，加入HIF-1α siRNA后，HIBEC迁移率明显下降（P＜0.05，见图3、表2）。Transwell检测结果显示，低氧培养后，侵入小室底膜的细胞数明显高于常氧培养，加入HIF-1α siRNA后，侵入细胞数明显减少（P＜0.05，见图4、表2）。

2.3 低氧通过HIF-1α上调HIBEC对TGF-β1的表达和分泌 与常氧培养相比，低氧培养HIBEC细胞内和培养基上清液中的TGF-β1 水平均明显增加，用siRNA抑制HIF-1α后，HIBEC细胞内和培养基上清液中TGF-β1水平均明显下降（P＜0.05，见表3）。

图1 3条siRNA对HIF-1α mRNA和蛋白表达水平的抑制效果

图2 干扰HIF-1α对低氧诱导EMT相关指标变化的影响

2.4 低氧/HIF-1α对HIBEC EMT的诱导作用部分依赖于TGF-β1 应用TGF-β1抑制剂LY364947，可以明显抑制低氧/HIF-1α对HIBEC的以下作用：上调Ecadherin、下调S100A4蛋白表达，提高HIBEC迁移和侵袭能力（P＜0.05，见图5-7、表4），但抑制TGF-β1对低氧诱导的HIF-1α表达增加没有明显影响。

图3 干扰HIF-1α对低氧诱导HIBEC迁移率变化的影响（×40）

图4 干扰HIF-1α对低氧诱导HIBEC侵袭性变化的影响（结晶紫染色，×200）

表2 干扰HIF-1α对低氧诱导HIBEC迁移和侵袭的影响（每组n=3）

表3 干扰HIF-1α对低氧诱导HIBEC表达和分泌TGF-β1水平的影响（每组n=3，pg/mL）

图5 抑制TGF-β1对低氧诱导EMT相关标志物表达的影响

3 讨论

EMT是上皮细胞表型和生物学特性发生变化，向间质细胞转化的一种现象，上皮细胞具有紧密连接、极性、不能移动等性质，其主要标志物是Ecadherin蛋白；而间质细胞则失去紧密连接，无极性，可移动，增殖力、迁移力和侵袭性均显著增强，其主要标志物是S100A4（也称为成纤维细胞特异蛋白1）等[5-7]。EMT现象最初是在胚胎中发现的，是胚胎发育中的重要调节因素，但后来研究表明，EMT也广泛存在于肿瘤的生长或转移以及纤维化疾病的形成过程中[8-10]。近来国内外研究发现，PBC的IBEC亦会发生EMT，这一过程对于PBC门管区纤维化可能具有重要意义[1-3]，但具体机制尚未明确。

本研究发现，低氧可以通过HIF-1α诱导HIBEC发 生EMT样变化，包括E-cadrherin下调、S100A4上调、细胞迁移性和侵袭性增加。低氧是PBC发生纤维化过程中门管区广泛存在的现象，据推测，低氧与PBC门管区新生血管增加以适应纤维化有关[4，11-12]， 但低氧对PBC的损伤靶点IBEC的作用情况，国内外尚罕有研究。本研究阐释了低氧对IBEC发生EMT的诱导作用，从而也为低氧与PBC肝纤维化的关系提供了一个新的线索。

图6 抑制TGF-β1对低氧诱导HIBEC迁移的影响（×40）

图7 抑制TGF-β1对低氧诱导HIBEC侵袭的影响（结晶紫染色，×200）

表4 抑制TGF-β1对低氧诱导HIBEC迁移性和侵袭性的影响（每组n=3）

TGF-β1 是与肝纤维化关系非常密切的一种重要细胞因子，参与了各种因素引起的肝纤维化、肝硬化过程[13-15]。ZHAO等[16]发现，脂多糖可以诱导IBEC发生EMT，TGF-β1在其中扮演了重要角色。本研究表明，在低氧诱导IBEC发生EMT的过程中，TGF-β1同样具有重要作用—低氧通过HIF-1α诱导HIBEC表达和分泌TGF-β1，而抑制TGF-β1明显阻止或逆转IBEC发生EMT，且不影响低氧对HIF-1α的活化。综上所述，本研究发现低氧可以通过HIF-1α诱导IBEC发生EMT，而这一作用主要是通过诱导IBEC分泌TGF-β1实现的。