黄芪糖蛋白通过调控Nrf2/NQO1信号通路保护急性脊髓损伤大鼠模型神经功能

史 悦，高 枫

(1.延安大学医学院，陕西 延安 716000；2.延安市中医院呼吸与危重症医学科，陕西 延安 716000)

脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)为临床一类严重损伤，表现为脊髓受损后其主要功能包括感觉、运动、反射等功能出现障碍。急性脊髓损伤发病急、致残率高，且治疗难度大，给患者及其家庭带来了沉重的负担，因此通过研究该病发病机制以探究更有效的治疗方法逐渐成为研究热点。有研究指出[1]，脊髓损伤后引起的机体免疫炎性反应，及其造成的继发性脊髓损伤是影响脊髓损伤患者预后的重要因素。因此减轻脊髓损伤早期炎性反应是治疗的关键之一。

黄芪成分众多，主要包括黄芪多糖类、黄酮类、皂苷类及多种微量元素，已被证实黄芪糖蛋白可有效降低自身免疫性脊髓炎小鼠脊髓组织中炎性细胞浸润，改善脱髓鞘[2]。氧化应激、炎症反应、凋亡与脊髓损伤发生发展密切相关，故本实验旨在探讨黄芪糖蛋白通过Nrf2/NQO1信号通路对脊髓损伤大鼠运动功能及炎症因子的影响，为黄芪糖蛋白在临床应用提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF清洁级健康雄性SD大鼠30只，随机分为假手术组、模型组及观察组，每组10只。鼠龄6～7周，体重220～250 g，实验动物由北京生命科学研究所动物实验中心提供，许可证号为SYXK(京)2018-0 003，本研究经动物伦理委员会批准，实验操作均遵守动物伦理保护法。

1.1.2 主要仪器 紫外分光光度计(752-P，上海佑科仪器仪表有限公司)；冷冻离心机(Microfuge20R，美国贝克曼库尔特有限公司)；PCR仪(CFX96，山东科艾瑞生物科技有限公司)

1.1.3 主要试剂 黄芪糖蛋白(纯度>98%，自制)。NaCl注射液(国药准字H20153227；湖北科伦药业有限公司)；RNAisoPlus试剂(宝生物工程大连有限公司)；FastQuant逆转录试剂盒(北京天根生化科技有限公司)；TNF-α检测试剂盒(上海天呈医流科技有限公司)；MPO检测试剂盒(上海康朗生物科技有限公司)；IL-6检测试剂盒(上海康朗生物科技有限公司)；Nrf2多克隆抗体(艾柏森生物科技有限公司)；NQO1多克隆抗体(武汉爱博泰生物科技有限公司)；BCA试剂盒(上海研生实业有限公司)；PMSF裂解液(上海联迈生物工程)。

1.2 方法

1.2.1 黄芪糖蛋白制备 从黄芪水提取液中经硫酸铵盐析，通过Sevage法将游离蛋白质去除，经透析与DEAE-C32阴离子交换树脂柱层析，分离纯化，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法分析得到黄芪糖蛋白；采用高碘酸-Schiff试剂染色法鉴定)。

1.2.2 急性脊髓损伤大鼠模型建立[3]假手术组大鼠切除T9～T11椎板及棘突，模型组及观察组大鼠切除T9～T11椎板及棘突后，采用改良Allen’s法击打大鼠T10节段脊髓，损伤直径2～3 cm。造模成功标准为：击打后大鼠全身抖动，后肢均回缩扑动且有摇尾反射，后肢均呈弛缓性瘫痪。术后立即给予大鼠腹腔注射9.0 mL/kg氯化钠注射液，直至大鼠清醒后放回饲养笼饲养。

1.2.3 给药方法 假手术组及模型组大鼠分别腹腔注射1.0 mg/kg 0.9%NaCl注射液，观察组大鼠给予腹腔注射1.0 mg/kg黄芪糖蛋白，1次/d，连续干预4周。

1.2.4 BBB评分 大鼠脊髓损伤模型造模成功及采用黄芪糖蛋白干预后采用BBB(basso,beattie & bresnahan locomotor raing scale,BBB scale)分级法对治疗后大鼠脊髓损伤后后肢功能恢复情况进行评价，通过将试验SD大鼠放置于宽敞的开口容器中，密切检测并观察大鼠爬行时其行走和驱干运动时膝关节和踝关节运动能力及协调情况，总分共计范围为0～21分，于干预1周、2周、4周评估大鼠肢体运动功能，分值越高表明大鼠后肢功能恢复越好，每只大鼠重复测试3次，取其平均值，本试验采用双盲、双人独立评分。

1.2.5 炎性及氧化应激因子水平 大鼠末次肢体功能评定后，脊椎脱臼法处死大鼠，暴露脊髓组织，取3组脊髓组织，分别将1 g脊髓组织与生理盐水按1∶9比例置于研钵内研磨、匀浆，2 500 r/min离心10 min，取上清，采用酶联免疫吸附法检测肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)、白细胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)水平。

1.2.6 实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR) 荧光定量PCR检测大鼠脊髓组织核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf 2)和醌氧化还原酶1(quinone oxidoreductase 1,NQO1)基因表达取约1 g脊髓组织于液氮置于研钵内研磨充分后，依照RNAiso Plus试剂说明书提取总RNA，采用紫外分光光度计检验纯度。然后使用FastQuant逆转录试剂盒逆转录cDNA，以cDNA为模板建立反应体系。以β-actin为内参，引物由TAKARA公司设计合成(引物序列见表1)。反应条件：95 ℃预变性15 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火15 s，共40个循环。通过2-△△Ct法计算Nrf2和NQO1mRNA表达量。

表1 引物序列

2 结果

2.1 各组肢体运动功能比较

假手术组、观察组、模型组大鼠术前运动功能评分比较差异无统计学意义(P>0.05)，干预1周、2周、4周后，观察组与模型组大鼠运动功能评分低于假手术组(P<0.05)，且观察组评分高于模型组(P<0.05，表2)。

表2 大鼠肢体运动功能比较

2.2 各组炎性因子水平比较

观察组、模型组大鼠TNF-α、MPO、IL-6水平高于假手术组(P<0.05)，且观察组因子水平低于模型组(P<0.05，表3)。

表3 大鼠炎性因子水平比较

2.3 各组大鼠脊髓组织Nrf2、NQO1mRNA表达水平

观察组、模型组大鼠脊髓组织Nrf2、NQO1mRNA表达水平低于假手术组(P<0.05)，且观察组表达水平高于模型组(P<0.05，表4)。

表4 大鼠脊髓组织Nrf2、NQO1mRNA表达水平

2.4 各组大鼠脊髓组织Nrf2、NQO1蛋白表达

假手术组、模型组、观察组大鼠脊髓组织Nrf2蛋白表达量为1.24±0.33、0.54±0.15、1.17±0.26，NQO1蛋白表达量为1.78±0.24、1.15±0.32、1.51±0.32；模型组与观察组Nrf2、NQO1蛋白量降低，且观察组高于模型组(P<0.05，图1)。

图1 各组大鼠脊髓组织Nrf2、NQO1蛋白表达情况

3 讨论

脊髓损伤发生后，机体会出现组织缺血性水肿、神经元坏死以及局部免疫炎性反应等一系列病理生理过程[4]。相关研究指出[5]，脊髓继发性损伤破坏血脊髓屏障，导致血管内容物渗出以及大量神经细胞凋亡，是导致脊髓损伤患者残疾甚至死亡的关键因素。而在脊髓继发性损伤发生过程中，免疫炎性反应占据重要地位。脊髓损伤后病变部位的微环境导致炎症细胞因子升高，炎症因子通过免疫炎症反应和级联放大炎症反应，促进破坏受损组织，加重病情。降低MPO、IL-6、TNF-α等细胞因子，能有效降低炎症反应，促进SCI恢复正常功能。有学者研究发现[6]，NF-κB在脊髓组织的星形胶质细胞、小胶质细胞、神经元细胞以及少突胶质细胞中均有表达，脊髓损伤发生时可激活神经细胞及胶质细胞上的NF-κB，活化的NF-κB进入细胞核，与靶基因启动子结合，促使靶基因表达，释放大量炎性细胞因子如TNF-α、IL-6，形成炎性扩增效应网络，加重继发性脊髓损伤。因此如何有效地抑制脊髓损伤后机体炎性反应是目前临床研究的热点。

黄芪糖蛋白提取自传统中药膜荚黄芪，已被证实具有显著抗氧化、抗炎、调节免疫功能等药理作用[7]。本研究中给予观察组急性脊髓损伤大鼠黄芪糖蛋白腹腔注射治疗，结果显示干预1、2、4周，观察组大鼠肢体运动功能均优于模型组，TNF-α、IL-6水平低于模型组，可见黄芪糖蛋白能有效抑制急性脊髓损伤大鼠炎性反应，改善神经功能，提高其运动能力。

文献报道[8]，Nrf2/抗氧化反应元件(antioxidant response element，ARE)是内源性抗氧化应激信号通路，激活该通路可显著提高细胞抗氧化应激能力。Nrf2是氧化应激反应感应器，属碱性亮氨酸拉链家族，NQO1为Nrf2/ARE信号通路的下游因子。张莉等[9]研究指出，诱导Nrf2/ARE信号通路活化，可增加其下游因子NQO1表达水平，在脑出血大鼠模型中发挥抗氧化应激损伤的作用。MPO是一种过氧化物酶超家族亚铁血红素酶，广泛存在于单核细胞以及中性粒细胞中，具备溶酶体酶和过氧化物酶活性，能介导炎症反应、脂质代谢以及氧化损伤等过程，在氧化应激反应中发挥重要作用。从本研究结果看，干预4周后假手术组、观察组、模型组大鼠脊髓组织MPO水平依次升高，Nrf2、NQO1mRNA及蛋白表达水平依次降低，可知观察组急性脊髓损伤大鼠氧化应激反应较轻，提示黄芪糖蛋白可能通过激活急性脊髓损伤大鼠Nrf2/ARE通路，上调NQO1表达，抑制氧化应激反应，达到降低继发性脊髓损伤的风险。

综上所述，黄芪糖蛋白能有效改善大鼠SCI情况，经黄芪糖蛋白治疗后后肢关节运动更协调、运动幅度增大、脚趾抓取力、负重前行力更大等。黄芪糖蛋白治疗SCI的作用机制可能通过Nrf2/ARE通路，上调NQO1表达降低IL-6、TNF-α、MPO含量，从而促进SCI大鼠的恢复。这提示黄芪糖蛋白在治疗SCI方面具有良好的临床效果和潜在的应用价值，为临床靶向治疗SCI并发症提供一定的的理论基础和可靠的实验数据。