环状RNA circ_002136在胶质瘤中表达水平及预后价值研究

景芸芸，张玉富

(1.西安市中心医院神经内科，陕西 西安 710000；2.空军军医大学唐都医院神经外科，陕西 西安 710038)

胶质瘤是我国最常见的颅内恶性肿瘤，其发病率和死亡率均位于颅内肿瘤前列[1]。虽然近年来包括手术切除、化疗和放疗在内的多种治疗方法不断发展，但由于胶质瘤术后易复发，对化疗药物敏感性差等原因，整体治疗效果仍不理想[2]。因此，研究胶质瘤的发病机制，探究具有早期诊断和评价预后价值的生物标志物，从而为胶质瘤的诊疗提供新的治疗靶点，具有重要的临床价值。

环状RNA(circular RNA，circRNA)是一类广泛存在于哺乳动物中的一种非编码RNA。不同于传统的线性RNA，circRNA无5′帽子结构及3′polyA尾，呈封闭环状结构，不易被常见的核酸外切酶降解，因此相比于线性RNA其表达更加稳定，具有成为理想的肿瘤标志物的潜能[3]。研究证明[4-6]，cricRNA可通过参与基因表达、肿瘤发生、增殖、转移等，引起细胞功能缺陷或异常，从而在多种肿瘤的发生发展中发挥重要作用，例如：肝癌、肺癌、乳腺癌等。在胶质瘤中，也存在多种异常表达的circRNA为胶质瘤患者诊疗及预后提供帮助，例如：circ_0005075可通过下调SIRT1来刺激胶质瘤的增殖和转移[7]；circ_001680在胶质瘤中表达水平明显上调，通过靶向抑制miR-186-5p促进肿瘤细胞生长[8]；胶质瘤中，过表达的环状RNAhsa_circ_0133159可作为胶质瘤的诊断和预后评估的标志物，具有极高的临床价值[9]。Circ_002136是与胶质瘤相关的癌基因，以前的研究表明，其在胶质瘤组织的表达明显升高[10]，然而，circ_002136与胶质瘤患者预后的关系尚未得到证实。因此，本研究的目的是通过检测circ_002136的表达，探讨circ_002136在胶质瘤中的临床意义及与预后的关系。

1 材料与方法

1.1 研究对象

胶质瘤组织标本与对应癌旁组织取自2012年7月至2015年1月在空军军医大学第二附属医院神经外科进行手术切除的39例胶质瘤患者，所有患者均在术前经影像学检查及术后病理结果证实为胶质瘤，并进行了WHO分级。其中男21例，女18例，年龄36～77岁。标本经手术切取后立即在-80℃液态氮冷冻储存直到RNA提取。所有患者均确诊为胶质瘤且排除以下情况：既往接受化疗、放疗、手术等任何抗癌治疗者；生命体征不稳定者；合并其他肿瘤者；合并严重的器质性疾病或凝血障碍者；随访资料缺失或失访者；不同意参加者。随访数据通过定期电话联系及患者复诊面谈的形式收集。本研究经空军军医大学第二附属医院伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。

1.2 实时荧光逆转录聚合酶链反应(RT-qPCR)

参照说明书，使用TRIzol试剂(Invitrogen，CA，USA)从胶质瘤组织及癌旁组织中提取总RNA。采用NanoDrop1000分光光度计(Nano Drop，Wilmington，DE，USA)测量RNA浓度和纯度，OD260/280在1.9～2.0范围内为合格。应用实时反转录聚合酶链反应(qRT-PCR)法配置逆转录反应体系，并以GAPDH为内参。PCR反应条件：95 ℃10 min预变性，然后按95 ℃40s，60 ℃ 30 s进行40个循环，最后72 ℃30 s。采用2-△△Ct法对qRT-PCR的结果进行分析，进一步得到在胶质瘤组织及癌旁组织中circ_002136的表达水平。计算出circ_002136表达水平的平均值，以平均值为界将患者分为高表达组和低表达组。所用引物购自西安顶尖生物科技有限公司序列如下：circ_002136引物序列：正向：5′-CTTTCCGAGACATTTGCTGG-3′；反向：5′-CATGGAGATCACAATAAGGAACTC-3′。GAPDH引物序列：正向：5′-GGACCTGACCTGCCGTCTAG-3′；反向：5′-TAGCCCAGGATGCCCTTGAG-3′。所有实验重复三次。

1.3 统计学方法

采用SPSS22.0(SPSSInc,Chicago,IL,USA)软件对所得数据进行统计分析。采用t检验分析胶质瘤组织与癌旁组织circ_002136表达的差异。然后使用χ2检验或Fisher精确检验，确定circ_002136表达水平与临床病理特征的关系。采用Kaplan-Meier法和log-rank检验评价总生存率，并计算生存率差异。采用Cox比例危险回归模型进行单因素和多因素分析，评估临床病理变量及circ_002136表达水平对总生存率的影响。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 Circ_002136在胶质瘤组织中的表达水平明显上调

为了确定circ_002136在胶质瘤组织中的作用，研究通过qRT-PCR检测胶质瘤组织中circ_002136的表达，发现与癌旁组织相比，胶质瘤组织中circ_002136水平显著升高[癌旁组织(1.00±0.2449)vs胶质瘤组织(2.967±0.3913)，P<0.01]，且高WHO分级(WHO Ⅲ-Ⅳ)和低WHO分级(WHO Ⅰ-Ⅱ)胶质瘤标本中circ_002136水平存在显著差异(WHOⅠ-Ⅱ，2.150±0.2918vs.WHOⅢ-Ⅳ，3.433±0.2642，P<0.01)，见图1。

图1 Circ_002136分别在胶质瘤组织Ⅰ-Ⅱ、Ⅲ-Ⅳ和癌旁组织中的表达水平

2.2 Circ_002136表达水平与胶质瘤患者临床病理指标的相关性

为确定circ_002136表达水平和胶质瘤的临床病理指标的相关程度，将39例组织样本分为circ_002136低表达组(21例)和circ_002136高表达组(18例)。然后分析circ_002136的表达水平与胶质瘤患者临床病理指标的相关性，其中临床病理指标包括年龄、性别、WHO分级、远处转移、肿瘤大小和肿瘤分化程度。结果表明：circ_002136的高水平表达与高WHO分级(P<0.01)、远处转移(P<0.01)密切相关，而与年龄(P>0.05)、性别(P>0.05)、肿瘤大小(P>0.05)无关(表1)。

表1 Circ_002136表达水平与胶质瘤患者 临床病理指标的相关程度(n)

2.3 高表达的circ_002136与胶质瘤患者总生存率降低显著相关

为了评估circ_002136的表达对胶质瘤患者临床预后的价值，通过对39名胶质瘤患者进行60个月的随访，采用Kaplan-Meier分析和Log-rank检验，探讨circ_002136表达水平和胶质瘤患者总生存期的相关性。生存分析的结果显示：circ_002136高表达的胶质瘤患者生存期明显低于circ_002136低表达的患者(P<0.05)，表明circ_002136表达升高与胶质瘤患者整体生存期缩短显著相关(图2)。

图2 Circ_002136高表达组和circ_002136低表达组患者术后生存率比较

2.4 Cox回归危险模型进行单因素和多因素分析

分别采用进行单因素和多因素分析评估circ_002136表达等临床病理特征表达水平作为胶质瘤预后指标的可能性。分析发现，circ_002136高表达水平、高WHO分级、远处转移是影响胶质瘤预后的危险因素(表2)。

表2 胶质瘤患者不同临床病理特征和circ_002136表达的单因素和多因素分析表

3 讨论

胶质瘤是最常见的恶性肿瘤之一，其死亡率一直居高不下[11]。由于胶质瘤早期症状隐匿，且进展快，多数患者错失最佳治疗时机[12]。因此研究胶质瘤致病机制，探索胶质瘤潜在的预后标志物和有效治疗靶点，并在此基础上发展胶质瘤的早期诊断和临床治疗策略具有重要医学意义。

环状RNA呈封闭环状结构，不易被核酸外切酶降解，它曾经被认为是因外显子转录本错误剪接而形成的低丰度RNA分子，随着科技的进一步发展，越来越多的证据表明circRNA是基因表达调控网络的重要组成部分，通过调控基因表达、调节选择性剪接和转录过程、作为竞争性内源性RNA(competing endogenous RNAs,ceRNA)发挥miRNA海绵作用等生物功能，影响机体多种病理生理学活动[13]。甚至有报道称，一些circRNA通过影响肿瘤细胞基因组表达，调节细胞发育，分化和凋亡，从而参与多种肿瘤的发生和发展过程。同时circRNA具有成为癌症生物标志物的潜能，并且有望作为预后指标。例如：在三阴性乳腺癌中，环状RNAhsa＿circ＿0058514在组织和细胞中呈高表达，并有望成为临床治疗的新靶点[14]；环状RNAcirc0002052在骨肉瘤组织中表达明显下调，可能提示骨肉瘤患者预后不良[15]；甲状腺乳头状癌中，上调环状RNAcirc_0025033通过海绵作用miR-1231和miR-1304促进肿瘤细胞增殖和侵袭[16]。最近多项研究表明，在胶质瘤中也存在多种circRNA表达异常[17]，例如：circ＿0014359和hsacirc＿0037251在胶质瘤组织表达显著高于癌旁非肿瘤组织，且与胶质瘤患者主要的临床病理因素密切相关[18-19]；胶质瘤中，circ_TTBK2过表达，敲除circ_TTBK2可抑制胶质瘤的增殖、侵袭、迁移和糖酵解[20]。作为circRNA家族中的一员，circ_002136被鉴定为一种胶质瘤的癌基因，并且已有研究证实它在胶质瘤中的作用机制：circ_002136作为miR-138-5p的海绵蛋白，通过FUS/circ_002136/miR-138-5p/SOX13反馈回路调节胶质瘤的发生发展[10]。但目前尚无关于circ_002136表达水平在胶质瘤中的预后价值及临床意义的研究，因此本研究旨在通过研究circ_002136在胶质瘤组织及其癌旁组织中的表达，进一步分析circ_002136表达与胶质瘤患者预后的关系。

研究表明，胶质瘤组织中circ_002136明显上调且与胶质瘤恶性程度呈正相关，这与之前的文献报道结果一致。circ_002136的表达水平与WHO分级、远处转移密切相关，而与年龄、性别、肿瘤大小无关。通过分析随访数据，证实circ_002136高表达患者的总生存率显著降低，提示circ_002136的上调可能是判断胶质瘤患者预后的有价值的标志物。

综上所述，在胶质瘤中circ_002136表达明显上调，其可作为预测胶质瘤患者预后因素，为胶质瘤的诊疗提供新的靶点。