高脂血症大鼠心肌中脂滴分布和H-FABP表达变化

孙晓鹏，郭康，郭志坤

1.新乡医学院河南省组织再生重点实验室，河南 新乡 453003；2.周口职业技术学院，河南 周口 466000；3.新乡医学院第三附属医院肿瘤内科，河南 新乡 453003

心是机体物质代谢非常活跃的器官，其功能实现依赖于持续的能量供应，成人心所需的ATP大约70%来源于心肌线粒体中β氧化的脂肪酸[1]。心型脂肪酸结 合 蛋 白（heart type fatty acid binding protein，HFABP）是一种由132个氨基酸组成的小分子可溶性蛋白质，分子量为15 Kda，在心肌细胞质中含量较为丰富，约占胞质蛋白总量的5%～15%，其主要功能是参与转运脂肪酸到线粒体进行β氧化[2]。有研究表明H-FABP在肌细胞中含量的变化主要与脂肪酸的利用有关[3]。多种生理实验证实脂肪酸摄取和代谢的增加可以提高H-FABP及其RNA的浓度，表明脂肪酸水平调控H-FABP基因的表达[4]。目前对H-FABP的研究主要集中于它作为急性心肌梗死的早期生物学标志物，而对其在高脂血症中的表达研究较少。本实验通过建立高脂血症大鼠模型，观察不同血脂水平大鼠心肌中脂滴含量和心功能，以及相应的H-FABP表达，旨在为进一步研究高脂血症大鼠心肌脂肪酸的代谢特点和临床治疗高脂血症提供实验依据和理论参考。

1 材料和方法

1.1 实验动物分组

清洁级雄性大鼠30只，体重180～200 g，新乡医学院实验动物中心提供，随机分为对照组15只，实验组15只；每组大鼠根据取材时间（4周、8周、12周）分为3个亚组，每个亚组5只。

1.2 实验方法

1.2.1 饲养与采血 对照组大鼠予普通饲料自然喂养，实验组予高脂饲料自然喂养。分别在饲养4、8、12周检测血脂。检测方法：取空腹大鼠，腹腔注射10%的水合氯醛麻醉，眼眶取血1 ml分离血清，全自动生化分析仪检测总胆固醇（total cholesterol，TC）和甘油三酯（triglycerides，TG）含量。

1.2.2 心功能检测 采血后应用高频探头行二维心超声检查，于左侧胸骨旁左心室水平做短轴切面采集左室二维图像，测定左心室舒张末期内径（Lvid：d）、左心室后壁厚度（Plvw：d）及左室射血分数（LVEF）。

1.2.3 心肌组织病理学观察 分别在饲养4、8、12周，禁食12 h后，麻醉处死大鼠，取心，10%多聚甲醛固定过夜，30%蔗糖溶液脱水，oct包埋，冰冻切片，厚度8μm，0.5%油红O避光染色，苏木素复染，甘油明胶封片观察。

1.2.4 脂滴透射电镜观察 大鼠禁食12 h后，心室切取1 mm×1 mm×1 mm心肌组织，立即放入2.5%的戊二醛中4℃浸泡2 h。PBS漂洗3次，每次15 min，然后放入10 g/L锇酸中固定2～3 h，PBS漂洗3次，每次15 min，乙醇梯度脱水。纯丙酮加包埋液（1：2）室温过夜，60℃烘箱固化24 h，切片，厚度60 nm。将切片经3%醋酸铀-枸橼酸铅双染色，JEM 1200透射电镜观察。

1.2.5 H-FABP免疫组化显色 将各组大鼠心用多聚甲醛固定24 h，30%蔗糖溶液脱水至心沉底。Pbs冲洗，oct包埋，冰冻切片，厚度8μm。37℃温箱烤片30 min，将切片置于柠檬酸盐缓冲液中（PH 6.0），微波炉加热10 min进行抗原修复，自然冷却至室温。PBS清洗3次，滴加3%过氧化氢浸泡20 min以封闭内源性过氧化物酶。而后依次滴加正常山羊血清（北京中杉金桥生物公司）浸泡20 min封闭非特异性抗原，1：200小鼠来源H-FABP抗体（abcam公司）及1：500 HRP标记的山羊抗小鼠IgG（北京中杉金桥生物公司）进行免疫组化染色，DAB显色，光学显微镜下观察。

1.2.6 H-FABP免疫荧光显色 37℃温箱烤片30 min，将切片置于柠檬酸盐缓冲液中，于高压锅内热处理2 min进行抗原修复。滴加3%过氧化氢浸泡20 min以封闭内源性过氧化物酶。0.3%Triton浸泡30 min进行细胞膜打孔，而后依次滴加正常山羊血清浸泡20 min，1：200小鼠来源H-FABP抗体（abcam公司）及1：500 CY3（北京中杉金桥生物公司）标记的山羊抗小鼠IgG，DAPI染核，激光共聚焦扫描显微镜观察。

1.2.7 Western blotting蛋白表达 每组取3只大鼠左心室标本分别进行组织匀浆，组织裂解液裂解，取上清液，BCA总蛋白定量，取等量蛋白样品进行SDSPAGE凝胶电泳，转膜，5%脱脂奶粉封闭1 h，依次加入1：500小鼠抗H-FABP单克隆抗体以及1：1000山羊抗小鼠HRP标记IgG。ECL发光检测，成像，显影。

1.3 统计学处理

采用SPSS 17.0统计软件进行分析，数据用均数±标准差（±s）表示。组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用t检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 高脂饮食大鼠血脂

实验组大鼠TG水平在第4周末、第8周末、第12周末明显高于同期对照组（P＜0.05，P＜0.01），3个实验阶段大鼠TG水平呈现先增高后下降趋势，但在第4周末与第8周末、第8周末与第12周末的结果比较差异不明显（P＞0.05）（图1A）。实验组大鼠TC水平在第4周末、第8周末、第12周末3个时相点明显高于同期对照组（P＜0.001），3个实验时相点TC水平逐渐升高，且差异显著（P＜0.001，P＜0.01）（图1B）。

2.2 高脂饮食大鼠心功能

超声心动图结果显示实验组大鼠Lvid：d、Plvw：d在第4周末、第8周末、第12周末明显高于同期对照组（P＜0.001，P＜0.01），在第4周末与第8周末、第8周末与第12周末之间比较有统计学差异（P＜0.05，P＜0.001，P＜0.01），（图2C、D），尤其是Plvw：d变化呈现逐渐增高的趋势。实验组大鼠LVEF在第4周末、第8周末、第12周末明显低于同期对照组（P＜0.001，P＜0.01），第4周末与第8周末比较无统计学差异（P＞0.05），第8周末与第12周末比较呈现明显下降（P＜0.001），（图2E）。

2.3 高脂血症大鼠心肌脂滴分布

心肌油红O染色结果显示，第4周实验组大鼠禁食12 h后，心肌内有大量的细小脂滴，广泛分布于肌原纤维之间。而对照组心肌细胞内几乎看不到脂滴存在。脂滴在第4周末含量最多，第8周末、第12周末脂滴含量逐渐减少（图3A～D）。透射电镜同样观察到在高脂饮食第4周心肌细胞内的脂滴最多。在心肌纵切面上，肌原纤维之间出现条状排列、大小不等的空泡，即脂滴（图3E～H）。有些细胞的脂滴位于细胞膜下（图3C）。在横切面上，脂滴位于线粒体和肌原纤维之间，大小不等，散在分布（图3F，G）。

图1 高脂饮食对大鼠血清TG、TC影响A：实验组和对照组在第4、8和12周TG水平B：实验组和对照组在第4、8和12周TC水平*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，ns P＞0.05Fig.1 Effects of high fat diet on TGand TCA:the TG levels of experimental group and control group at the4th week,the 8th week and the 12th week；B:the TC levels of experimental group and control group at the4th week,the 8th week and the12th weekNote:*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001,ns P＞0.05

图2 高脂饮食对大鼠心功能影响A：对照组左心室超声心动图B：实验组左心室超声心动图C、D、E：实验组与对照组在第4、8和12周左心室舒张末期内径、左心室厚壁厚度、左心室射血分数*P＜0.05、**P＜0.01、***P＜0.001，ns P＞0.05Fig.2 Effects of high-fat diet on cardiac functionA:left ventricular echocardiography in the control group；B:left ventricular echocardiography in the experimental group；C、D、E:the left ventricular diameter at end-diastole,left ventricular thick-wall thickness and left ventricular ejection fraction were measured at the 4th week,the 8th week and the12th week*P＜0.05、**P＜0.01、***P＜0.001，ns P＞0.05

2.4 高脂血症大鼠心肌H-FABP的免疫表达

免疫组织化学显色显示，实验组和对照组大鼠各个时相点心肌细胞中H-FABP主要表达于胞浆内，呈现棕黄色颗粒。与对照组相比，实验组在3个时相点的H-FABP表达依次增加，第12周增加最为显著（图4）。免疫荧光显色显示H-FABP在3个时间点逐渐增强，与免疫组化结果一致（图5）。Western blotting检测显示实验组大鼠心肌中H-FABP表达量高于对照组，随着实验进程H-FABP表达逐渐增加，对照组各时段没有差异（图6A、B）。实验第4周与同期对照组相比表达无统计学差异（P＞0.05），（图6C）。实验第8周、12周与同期对照组相比表达显著增多（P＜0.001），（图6D、E）。

3 讨论

图3 大鼠心肌细胞脂滴A：对照组心肌内未见脂滴CON：对照组B～D：光镜下高脂饮食第4、8和12周心肌细胞脂滴分布（油红O染色）E～H：电镜下高脂饮食第4、8和12周心肌细胞脂滴的亚微结构分布E和F为心肌细胞纵切面G和H为心肌细胞横切面 箭头示脂滴Fig.3 Lipid droplets in myocardial cells of high-fat diet ratsA:no lipid droplets in myocardial cells of the control group；B～D：the distribution of lipid droplets in myocardial cells under light microscopy at the 4th week,the 8week and the 12 week,oil red O staining；E-H:the ultrastructural distribution of lipid droplets in hyperlipidemic myocardial cells at the 4th week,the 8th week and the 12th week；E and F were the longitudinal sections of cardiomyocytes；G and H were the transverse sections of cardiomyocytes,arrows indicated lipid droplets

图4 不同阶段高脂饮食影响大鼠心肌细胞H-FABP免疫组化表达 CON：对照组Fig.4 Immunohistochemical staining of H-FABP in cardiomyocytes CON:control group

心是人体能量需求较高的器官，为维持正常心功能，需要保证足够的能量持续供应心，因此，心肌细胞活动有赖于ATP的持续生成。在能量代谢过程中，糖和长链脂肪酸是心主要的能量来源[5,6]。虽然糖的氧化是心肌ATP的重要来源，但健康成人的心肌ATP 50%～70%来自长链脂肪酸[7]。心肌获得脂肪酸主要来自循环系统中甘油三酯水解后与白蛋白结合的游离脂肪酸以及极低密度脂蛋白水解的脂肪酸[8]。获取的脂肪酸除供线粒体氧化供能外，其余部分以三酰甘油的形式储存于心肌细胞的脂滴中，并在需要时由三酰甘油脂酶（ATGL）水解为脂肪酸和甘油[9]。

长链脂肪酸是主要的脂类，但游离长链脂肪酸不溶于胞质，它们在细胞内的转运需要脂肪酸结合蛋白帮助。脂肪酸结合蛋白（FABPs）是胞质内可溶性的小分子蛋白（14-15Kda）家族，可以结合长链脂肪酸[10]。心型脂肪酸结合蛋白（H-FABP）是FABPs家族主要成员，由FABPs3基因编码，主要分布于心肌和骨骼肌[11]，结合并转运长链脂肪酸至线粒体进行氧化。研究表明，HFABP可以刺激心肌细胞肥大[12]。H-FABP近年来作为心肌梗死早期生物学标志物越来越被重视，据载，在急性心肌梗死30 min内，H-FABP从胞质释放入血液循环[13]。

高脂血症是冠心病最大的风险因子[14]，高脂血症是指血清TC、TG、LDL、VLDL升高和HDL降低，其中高胆固醇血症和高甘油三酯血症与缺血性心病密切相关[15]。高脂血症患者血液中胆固醇和甘油三酯水平升高，心肌细胞摄入的脂肪酸随之增加，作为长链脂肪酸的转运蛋白H-FABP表达也会增高，但对于高脂血症患者H-FABP的表达和血脂水平的关系以及对心肌脂肪酸代谢的影响却鲜有研究。

图5 大鼠心肌细胞H-FABP免疫荧光表达A～C：对照组CON：对照组D～F：实验4周组G～I：实验8周组J～L：实验12周组A、D、G、J：H-FABP表达B、E、H、K：Dapi标记细胞核 C、F、I、L：前两列的叠加Fig.5 Immunofluorescence expression of H-FABP in cardiomyocytes of hyperlipidemic ratsA-C:control group；D-F:the 4 week experimental group；G-I:the 8 week experimental group；J-L,the 12 week experimental group；A，D，G，J:H-FABP expression；B，E，H，K:dapi labeled nucleus；C，F，I，L:merged the first two columns

本研究通过生化指标的检测，运用油红O染色光镜和电镜观察大鼠心肌组织脂滴沉积变化，以及对H-FABP的免疫组化、免疫荧光，Western blotting表达和心功能进行检测，初步揭示了高脂血症大鼠心肌脂肪酸代谢的特点以及心肌形态和功能的影响。结果显示，随着高脂饲料喂养时间的延长TC水平显著升高，而TG水平增加不明显，并在第12周末出现降低。这种现象在其它实验的造模过程中也曾出现，可能机制是脂质代谢紊乱加重及血中TG水平升高，肝起到贮存TG的缓冲作用，大量的TG向肝内转移，肝功能损伤至一定程度时，其代谢转运TG的能力便会大大减弱[16]。组织学结果显示，高脂血症大鼠心肌细胞内肌原纤维间出现脂滴储积，而正常大鼠心肌细胞中无明显脂滴，说明高脂饮食使心肌的脂肪酸摄入增多，超过了心肌脂肪酸的β氧化能力，多余的脂肪酸以甘油三酯形式贮存在心肌细胞的脂滴内，最终导致心肌发生脂肪变性。但是本实验还显示，随着高脂饮食时间延长，血脂浓度升高，反而导致大鼠心肌内的脂滴减少。如何解释这一看似相互矛盾的现象？通过免疫组化、免疫荧光和Western blotting表达显示，随着造模时间的延长心肌H-FABP表达量逐渐增加，这可能是高脂饮食持续一定时间后心肌内脂滴下降的根本原因。因为H-FABP主要作用是转运脂肪酸至线粒体进行β氧化，H-FABP增多，脂滴分解加快，脂肪酸的β氧化增加，心肌细胞内的脂滴数量也会减少。如果继续延长高脂饮食喂养时间，是否会出现HFABP下降（衰竭），心肌细胞内的脂滴再次增多，加重心肌变性，而导致心功能障碍等，尚需进一步研究。

图6 对照组与高血脂大鼠心肌组织H-FABP的表达CON：对照组ns P＞0.05，***P＜0.001Fig.6 Expression changes of H-FABP in myocardium of hyperlipidemia rats in the control groupCON:control group,ns P＞0.05,***P＜0.001

有大量的证据表明脂质及其代谢的中间产物可以导致心肌的脂毒性损伤，心肌脂毒性可以造成心肌胰岛素抵抗，心肌细胞凋亡和心收缩功能障碍[1]。在脂肪酸的氧化过程中会伴随活性氧簇（reactive oxygen stress，ROS）的产生，ROS增加可诱导心肌肥厚和心肌细胞功能紊乱[17]。本研究通过二维超声心动图检测发现高脂血症大鼠与对照组相比Lvid：d明显增大、Plvw：d明显增厚，LVEF明显下降，随着血脂浓度的升高这种变化更为显著。这表明高血脂已明显影响大鼠的心功能。但本研究发现大鼠心肌内脂滴的增多与心功能变化并不一致，脂滴明显增多时，心功能下降反不明显，随着脂滴数量的减少心功能出现明显下降。这种结果可能与高血脂大鼠心肌的脂毒性损伤有关。因为心肌脂肪酸的β氧化增多，同时伴随ROS生成增加，导致对心肌细胞造成损伤，另外H-FABP高表达也可以造成对心肌细胞的刺激[12]。

综上所述，高脂饮食可使大鼠心肌内脂滴增多，心肌发生脂肪变性，随着血脂浓度的升高，H-FABP的表达明显增加，心肌脂肪酸的β氧化增强，心肌中脂滴含量减少，但心功能下降。然而相关机制仍不清楚，需要进一步探索。