谷氨酰胺转氨酶对全麦面团特性及微观结构的影响

王佳玉，陈凤莲，吴 迪，汤晓智,*

（1.哈尔滨商业大学食品工程学院，黑龙江 哈尔滨 150076；2.南京财经大学食品科学与工程学院，江苏省现代粮食流通与安全协同创新中心，江苏高校粮油质量安全控制及深加工重点实验室，江苏 南京 210023）

全麦粉是由整粒小麦研磨而成，包含了胚乳、麸皮与胚芽，含有丰富的膳食纤维和多种微量元素，长期摄入可有效预防糖尿病、心血管疾病等慢性疾病的发生[1]。但由于全麦粉中存在着大量纤维，致使全麦食品的口感质地及消费者可接受度降低[2]。

谷氨酰胺转氨酶（glutamine transaminase，TG）能催化蛋白质分子发生交联，可以有效改善面团的流变特性[3]。魏晓明等[4]研究发现，TG能够促进荞麦面条中蛋白质交联，使得荞麦面条的微观结构得到改善，同时提升了荞麦面团的加工特性及面条的品质。Huang Weining等[5]通过添加TG研究其对燕麦面团流变学和热学性质的影响，结果表明添加TG改变了燕麦面团的热机械性能，TG的加入对储能模量（G’）和损耗模量（G’’）有显著影响，并证实了TG催化燕麦蛋白质交联。彭飞等[6]通过在燕麦中添加TG改善面条蒸煮品质。Niu Meng等[7]研究了TG和葡萄糖氧化酶对全麦面团中蛋白质聚合的影响。本研究着重探讨TG添加量及作用时间对全麦面团的混合特性、拉伸特性、流变特性、微观结构和蛋白质分子质量变化的影响，旨在为提高全麦食品品质提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

全麦粉（淀粉65.65%、蛋白质14.75%、脂肪2.02%、粗纤维1.53%、水分11.63%） 海宁中粮面业有限公司；TG（12 000 U/g） 泰兴市东圣生物科技有限公司；4×蛋白质上样缓冲液（含巯基）、5h Tris-甘氨酸电泳缓冲液 北京索莱宝科技有限公司；OCT冰冻切片包埋剂 北京瑞茂宏达科技有限公司。

1.2 仪器与设备

Mixolab混合实验仪 法国肖邦技术公司；冷冻切片机深圳达科为医疗设备有限公司；TM-3000扫描电镜日本日立公司；Anton Paar MCR 302动态流变仪 奥地利安东帕有限公司；TA-XT2i型质构分析仪 英国Stable Microsystems公司；Nikon Ti-E-AIR型激光共聚焦显微镜日本Nikon公司。

1.3 方法

1.3.1 原料制备

TG添加到全麦粉中，添加量为0、0.6、1.2、1.8、2.4、3.0 U/g（按全麦粉质量计），与全麦粉混合均匀后备用。

1.3.2 面团热机械学特性测定

采用Mixolab混合实验仪，测定程序为Chopin+，面团质量规定75 g。其中每个样品重复3 次。

1.3.3 拉伸特性测定

参考Liu Wenjun等[8]的方法。样品采用Mixolab混合实验仪混成的面团，在扭矩达1.1 Ng m时取出面团，放入质构仪SMS/KIE拉伸测定的面团制备槽中，并用压板压制成2 mmh 60 mm的面团条。静置90 min后，将面团条从面团制备槽中取出，放在质构仪面团的拉伸位置，探头上升直到面团条断裂，得到面团的抗拉伸力（g）及拉伸距离（mm）。

1.3.4 流变特性测定

参考Torbica等[9]的方法测定TG添加量和作用时间对全麦面团样品流变特性的影响，测定方法稍作修改。样品取Mixolab混合实验仪制备的面团，面团样品在扭矩为1.1 Ng m时取出，并用保鲜膜包裹静置15、45、60、90、120 min。使用Anton Paar MCR 302流变仪，采用平板直径为25 mm的转子（PP25），设定平板间距为1 mm。面团样品装载完成后，设定静置时间为10 min，以消除残余应力，并用矿物油密封面团边缘，防止水分散失。测得样品线性黏弹区为0.01%～1.0%，设定频率变化范围为0.1～20.0 Hz，样品测试温度为25 ℃，获得面团的储能模量（G’）、黏性模量（G”）和黏性角正切值tanδ（G’/G”）。

1.3.5 扫描电镜观察

参照汤晓智等[10]的方法稍作修改，取Mixolab混合实验仪混合时扭矩达1.1 Ng m时取出的面团样品，并用保鲜膜包裹，静置90 min。静置后面团放入-20 ℃冰箱12 h，取出后冷冻干燥（-80 ℃，72 h），离子溅射喷金后扫描电子显微镜下观察。

1.3.6 激光共聚焦显微镜观察

参考Han Wen等[11]的方法稍作修改，将制备的不同添加量TG的面团样品与包埋剂放入-20 ℃冰箱12 h，使用莱卡VT1200S型振动切片机从面团内部切下厚度为10 μm的薄片，立即转移到显微镜载玻片上，用荧光染料罗丹明B（0.1 μg/mL）和异硫氰酸荧光素（0.1 μg/mL ）染色后使用Nikon A1激光共聚焦显微镜100 倍下观察，设置通道发射波长为488.0 nm和543.5 nm，1 024h 1 024分辨率下观察图片。

1.3.7 蛋白质分子质量变化

参考Luo Yun等[12]的方法测定加入TG后全麦面团样品中蛋白质分子质量的变化。TG处理后的面团样品放入-20 ℃冰箱12 h，将冷冻处理后的面团样品进行冷冻干燥（-80 ℃，72 h），并研磨成冻干粉过60 目筛。取面团样品冻干粉7 mg放入离心管中，加入稀释后的蛋白质上样缓冲液1 mL，混合均匀后沸水浴加热5 min，12 000hg离心15 min，取上清液10 μL加入凝胶中，电泳浓缩胶设定电压80 V，分离胶电压100 V。凝胶用0.25%考马斯亮蓝染色，20%甲醇和10%乙酸脱色。

1.4 数据收集和统计

采用SPSS 16.0和Origin 8.5软件对数据进行分析处理，采用Duncan法进行显著性分析（P＜0.05，差异显著）。

2 结果与分析

2.1 TG对全麦面团混合特性的影响

表1 TG对全麦面团混合特性的影响Table 1 Effect of TG on mixing characteristics of whole wheat dough

如表1所示，随着TG添加量的增加，全麦面团在混合过程中吸水率、面团形成时间、稳定时间、蛋白质弱化度均呈现先升高后降低的趋势，峰值黏度呈上升趋势，回生值显著下降。李鑫等[13]研究TG对小麦粉品质影响结果显示，添加TG可以促进蛋白分子聚集，改善面筋网络结构，使得面团的形成时间和稳定时间增加。Mixolab混合实验仪可以反映面团混合过程中机械剪切应力和温度双重作用下蛋白质和淀粉特性的变化，而面团的形成过程实质上是面筋蛋白吸水形成面筋网络的过程，因此随着TG添加量升高，短时间内可能导致蛋白质局部交联聚集，反而影响了面筋蛋白吸水形成良好面筋网络的过程，游离于面筋结构外可糊化的淀粉总量增加，从而导致吸水率下降，面团形成时间、稳定时间先升后降，蛋白弱化度升高以及淀粉峰值黏度升高。随着TG添加量的增加回生值显著降低，由于全麦面团在机器中搅拌时间以及酶反应时间的延长，TG较充分地诱导了全麦面团中蛋白质分子发生交联，形成良好的面筋网络结构，同时面团体系变得均匀，糊化后淀粉均匀镶嵌在面筋结构中，导致在降温过程中回生值降低[14]，这与王雨生等[15]研究结果一致。回生值的降低有利于提升烘焙产品的品质及延长货架期。

2.2 TG对全麦面团拉伸特性的影响

表2 TG对全麦面团拉伸特性的影响Table 2 Effect of TG on tensile properties of whole wheat dough

如表2所示，随着TG添加量的增加，拉伸阻力随之增加。拉伸距离与拉伸阻力呈现出相反趋势，说明TG诱导蛋白质分子交联，形成大分子的聚集体，其有效增强了全麦面团的强度，但使其延展性变差，从而导致拉伸阻力的增加和拉伸距离减小[16]。当TG添加量3.0 U/g时，面团强度有所下降，结合Mixolab混合实验仪结果可知，适当控制酶反应时间对蛋白质的交联以及良好的面筋网络的形成至关重要，也直接影响了面团的拉伸特性。

2.3 TG对全麦面团流变特性的影响

由图1可知，在不同的反应时间下，所有全麦面团随着TG添加量的增加，G’随之增加。随着反应时间的延长，G’相应增加。结果表明TG诱导了蛋白质分子交联，显著增加了全麦面团的强度[17-19]。添加TG后全麦面团样品的G”变化（图2）与G’的变化结果相似，均呈现随着添加量的增加以及反应时间的延长持续增加。全麦面团的综合黏弹性可以用损耗角正切值（tanδ）反映（图3）[20]。全麦面团的tanδ值与其黏性和弹性模量呈现出相反的变化趋势，即TG添加量越高，tanδ值越低。当酶反应时间达到120 min时，各添加水平的综合黏弹性变化曲线趋于重合，tanδ值不再继续降低，甚至开始升高。由结果分析，TG的加入进一步促进了全麦面团中蛋白质分子之间发生交联，并聚集缠绕，形成良好的面筋网络结构，一定程度上消除了全麦中粗纤维等对面团强度的影响，使得全麦面团的黏弹性增加。但当过量添加或者过长时间反应，易造成蛋白质过量交联及聚集，反而不利于全麦面团的综合黏弹性。Ndayishimiye等[21]研究发现，TG减少了谷蛋白和麦醇溶蛋白的含量，同时引入了新的交联键，导致G’和G’’增加。随着TG添加水平的增加以及反应时间的延长，会形成更多的交联[22]。Bauer等[23]研究也表明，TG添加使得小麦面团强度增加，但TG浓度过高会导致面筋网络结构完全丧失，面团加工性能变差。因此，在实际应用中，应选择合适的TG浓度同时适度控制酶反应时间。

图1 TG添加量及反应时间对全麦面团弹性模量（G’）的影响Fig.1 Effect of TG dosage and reaction time on G’ of whole wheat dough

图2 TG添加量及反应时间对全麦面团黏性模量（G”）的影响Fig.2 Effect of TG dosage and reaction time on G” of whole wheat dough

图3 TG添加量及反应时间对全麦面团损耗角正切值（tanδ）的影响Fig.3 Effect of TG and reaction time on tanδ of whole wheat dough

2.4 扫描电镜观察结果

全麦面团（图4a）中因存在大量麸皮，使得面筋结构在形成过程中被阻断，导致面团的微观结构出现大量孔洞和断面。图4b与4c显示了添加TG后全麦面团微观结构的变化，从图中可知，添加TG后，面筋网络结构的空洞与断面明显减少，面筋结构变得连续均匀，淀粉颗粒、纤维被很好地分散在面筋网络结构中，说明在TG的作用下，面筋蛋白发生聚集与交联，全麦面团的微观结构得到明显改善[24-25]。对比不同添加量，酶反应时间为90 min条件下，TG添加量为3.0 U/g时全麦面团的微观结构较1.8 U/g更加完整紧致。

图4 扫描电镜观察TG对全麦面团微观结构的影响Fig.4 Effect of TG on microstructure of whole wheat dough observed by SEM

2.5 激光共聚焦显微镜观察结果

未添加TG的全麦面团（图5a）中存在大量麸皮，破坏了面团内部连续结构，出现大量空洞；添加TG后的全麦面团如图5b、c所示，可以明显观察到在TG的作用下面团中的孔洞数量及断裂空隙减少，麸皮周围结构变得连续，面筋交联紧密[26]。同时，从图中可以观察到，当添加量为3.0 U/g时，面团微观结构中的连续性优于1.8 U/g添加量时的面团，其可以将麸皮与面筋结构的结合的更加紧密，在麸皮存在处减少断裂空隙，增加面团整体的连续性，利于加工。

图5 激光共聚焦显微镜观察TG对全麦面团微观结构的影响Fig.5 Effect of TG on microstructure of whole wheat dough observed by CLSM

2.6 TG对全麦面团蛋白质变化的影响

图6 TG对全麦面团中蛋白质变化的影响Fig.6 Effect of TG on SDS-PAGE protein profile of whole wheat dough

从图6可以清晰观察到加入TG后蛋白质变化的情况。与全麦粉样品条带相比，TG样品条带在20～100 kDa处总体减少，在100～245 kDa处增加。从变化可知，TG的加入，使得小分子质量蛋白质减少，小分子蛋白质相互交联并聚集成大分子蛋白质，从而使得大分子质量处条带增加；在TG样品条带上端（分离和堆积凝胶顶部）显示出大的聚集体（分子质量大于245 kDa的蛋白质），说明TG的存在使得大量小分子蛋白质交联聚集成大分子[27-28]，面筋蛋白的适当交联形成网络结构可以有效弥补麸皮对面团的影响，使全麦面团内部结构连续均匀[29]，有研究表明[30]，TG催化形成的蛋白质分子交联对面粉或面团中面筋蛋白分子质量有很大影响，TG处理面粉或面团后，麦醇溶蛋白和谷蛋白的含量显著减少同时大分子质量蛋白质含量增加。Aalami等[31]研究小麦面团的电泳结果表明，TG催化的蛋白质交联反应，形成了更高分子质量的聚合物，且随着TG浓度的增加，聚合度增加，出现了更高分子质量的新条带。但当过度交联时可能导致蛋白质分子质量过大，成片聚集，不利于形成良好的面团网络结构。

3 结 论

随着TG添加量的增加，全麦面团在混合过程中吸水率、面团形成时间、稳定时间、蛋白质弱化度均呈现先升高后降低的趋势，峰值黏度呈上升趋势，回生值显著下降；拉伸特性结果验证了TG可以增强面团强度；流变特性表明适当的TG添加量及酶反应时间使得全麦面团的黏弹性增加，但当过量添加或者过长时间反应，易造成蛋白质过量交联及聚集，反而不利于全麦面团的综合黏弹性。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳、扫描电镜与激光共聚焦显微镜证实了TG诱导蛋白质分子发生交联和聚集，消除了全麦中纤维等对面团强度的影响，使得面团微观结构均匀连续。