温针灸对膝骨关节炎大鼠P53、Map2k3和PGE2的影响

王华敏,宓轶群,赵媛媛,张永亮

(1.上海交通大学附属第六人民医院,上海 200233;2.河北医科大学第二医院,石家庄 050000)

膝骨关节炎(Knee Osteoarthritis, KOA)是一种多发生于中老年人的慢性骨关节炎疾病,关节软骨退变、滑膜增生与炎症是该病的主要病理特征。该病具有高发病率、高增长率和高致残率。有文献研究表明前列腺素E2与KOA发病关系密切[1-2]。近年来相关研究表明KOA的发病与多条信号通路中的相关mRNA调控有关[3-4],本实验通过检测 KOA大鼠外周血清中前列腺素E2(Prostaglandin E2, PGE2)含量及滑膜组织中肿瘤抑制蛋白P53(Tumor proteinp53, P53)和促分裂原活化蛋白激酶 3 (Mitogen-activated proteinkinase kinase 3, Map2k3)mRNA的表达情况,探讨温针灸治疗KOA的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

28只健康的清洁级雄性 3月龄 SD大鼠,体质量(270±30)g,购于上海西普尔-必凯实验动物公司[生产许可证号为SCXK(沪)2013-0016]。饲养环境自然光每日光照12 h,温度18℃～22℃,相对湿度50%～70%,每笼7只,自由饮水、摄食,常规饲养1周后按随机数字表法分为正常组、模型组、药物组和温针灸组,每组7只。实验过程严格遵守实验动物管理条例。

1.2 主要试剂和仪器

小艾炷(上海泰成科技发展有限公司),针灸针(固始公元医疗器械有限公司),美洛昔康片(7.5 mg/片,国药准字 H20020217,上海勃林格殷格翰药业有限公司),papain(P-3250,Sigma公司),EDTA、NaOH、NaCl、Na2HPO4、HCl(上海化学试剂公司),离心机(Sigma公司),MK3型酶标仪(Thermo公司),PGE2ELISA检测试剂盒(KGE004B,RD公司),RNA酶抑制剂(RG90925,Epicentre公司),SuperScriptTMⅢ逆转录酶、5×RT缓冲液(Invitrogen公司),Primer(英骏生物技术有限公司)。其他涉及的试剂设备和仪器均由上海交通大学附属第六人民医院实验中心提供。

1.3 溶液配制

木瓜蛋白酶(papain)溶液的制备[5]方法为 32 mL双蒸水中加入0.05 g NaH2PO4、0.72 g Na2HPO4、0.04 g NaOH和1.6 g NaCL,混合轻搅溶解后加入NaOH,pH浓度调至8.0,加0.64 g papain和15 mg EDTA-2Na,轻搅溶解后液体呈淡黄色,最后加入 HCL将 pH值调至6.5,双蒸水定溶至40 mL后低温保存。美洛昔康溶液的制备,选用临床抗炎镇痛疗效显著的美洛昔康片,将其碾磨粉碎后溶解于生理盐水,反复摇匀后制成0.5 mg/mL溶液。

1.4 模型制备

除正常组外,其余3组采用关节腔注射papain结合被动运动的方法造模[6-7],准备好配制好的papain溶液、手套和75%医用乙醇棉球等,将大鼠固定在解剖板,充分暴露并屈曲双侧后肢45°,常规消毒3遍关节腔周围的皮肤,注射器快速破皮后斜刺入关节腔,当针下有落空感时外提回抽无血即可注射papain溶液。根据临床过度运动易损伤关节造成炎症反应的特点,无固定状态下用自制滚筒每天强迫大鼠超负荷运动15 min;3组大鼠分别于第1天、第4天、第7天关节腔注射 papain,单膝单次注射 0.1 mL,2周后通过Lequesne MG膝关节级别评估,观察局部反应、步态反应、关节活动和关节肿胀4个方面,与正常组相比,造模的 3组大鼠差异有统计学意义(Kruskal-Wallis分析局部反应,P=0.00039;步态,P=0.00037;关节活动,P=0.00025;关节肿胀,P=0.00048),提示动物模型制备成功。详见表1。

表1 造模后各组大鼠膝关节评估 (例)

1.5 干预方法

正常组与模型组采用与温针灸组相同的抓取和固定,余不做特殊处理。温针灸组诱导大鼠进入固定器后仰卧固定于解剖板,将大鼠后肢双侧膝关节弯曲 45°便于关节腔的暴露和穴位的定位,揣摩并定位大鼠“膝前穴”(后肢膝盖前方),穴位定位参考《实验针灸学》及相关文献[8-9],用 75%乙醇棉球消毒 3遍后持 0.25×25 mm针灸针迅速刺入,刺入深度为5～7 mm,随后将长度为7 mm,直径为5 mm,重量为0.5 g的小艾炷插入并固定于针柄处,点燃后其燃烧完成后换另外一炷,待其充分燃烧完成后即可拔掉针灸针(约为 10 min),每日1次,每次2壮,连续治疗10 d。药物组抓紧大鼠背部皮肤,垂直固定身体,充分后仰头部便于打开嘴巴,将灌胃针沿咽后壁方向从嘴角慢慢插入,当进针深度约为4～5 mm时回抽观察是否有气泡,如若无气泡则可慢慢推注,推完后迅速出针,药物组大鼠灌胃后采用与温针灸组相同的抓取和固定。根据人和大鼠体质量换算比例 SD大鼠服用美洛昔康溶液的剂量为3.75 mg/kg,每日1次,连续灌胃10 d。

1.6 观察指标与检测方法

治疗结束后采用腹腔注射戊巴比妥钠麻醉后处死大鼠,腹主动脉采血 5～10 mL,滴入离心管,随后以3000 rpm/min,离心3 min,分离出血清,-80℃保存,留待ELISA检测。摘取大鼠的双侧膝关节,切开皮肤逐层打开并充分暴露关节腔,手术刀沿髌骨下缘向上钝性分离和剥取滑膜组织,将分离好的滑膜组织放入离心管中置于-80℃冰箱保存,留待HE染色和实时定量PCR检测。

1.6.1 组织形态学观察

采用HE染色观察4组大鼠滑膜组织形态学改变。将滑膜组织浸泡于10%的福尔马林溶液中,24 h后取出行脱水处理,脱水完成后浸泡于二甲苯中,待组织透明后进行石蜡包埋处理,切片处理后贴到载玻片上,放入45℃恒温箱中烘干;染色之前需要将切片中的蜡块祛除,具体步骤为将切片放置于二甲苯中 30 min,置于100%乙醇中10 min,置于80%乙醇中5 min,置于蒸馏水中5 min后即可染色。苏木精染色、冲洗、脱水、伊红染色、冲洗、封片,最后在电子显微镜下观察各组切片染色结果。

1.6.2 血清PGE2蛋白含量检测

依据ELISA试剂盒操作步骤检测血清PGE2蛋白含量。取出血清和 ELISA试剂盒,室温下平衡,设立 10个标准孔,2个非特异结合孔,其他为样品孔,先后加入150 μL相应的试剂和样品,50 μL一抗(除了非特异结合孔),封板,置于水平摇床(500±50)rpm孵育1 h;不洗板,每孔加入 50 μL PGE2结合液,封板,室温摇床孵育2 h;置于自动洗板机上,Wash Buffer洗板4次。每孔加200 μL底物溶液,避光静置孵育30 min。每孔加入100 μL终止液后,30 min内用酶标仪检测光密度和浓度。

1.6.3 P53和Map2k3 mRNA表达检测

采用实时定量 PCR法检测,取滑膜组织样品加入Trizol试剂混合匀浆,通过氯仿,异丙醇进行RNA的提取,紫外吸收法测定 RNA的浓度和纯度;将提取好的RNA样品进行cDNA的合成,完成后-20℃冰箱保存;将所有的cDNA样品分别配置Realtime PCR反应体系进行PCR反应,P53 mRNA、Map2k3 mRNA和管家mRNA GAPDH的浓度结果由机器生成,采用 GAPDH作为内参来校正差异,结果选用待测 mRNA相对含量(每个样品的浓度除以其管家的浓度,即为此样品mRNA校正后的相对含量)。实时定量PCR使用引物列表详见表2。

表2 引物列表

1.7 统计学方法

采用SPSS21.0软件统计分析各组实验数据。符合正态分布的计量资料用均数±标准差表示,采用单因素方差分析;不符合正态分布的计量资料用中位数,(四分位数)表示,两独立样本组间比较用非参数检验。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 滑膜组织形态学观察

正常组可见大量的脂肪细胞和滑膜细胞,模型组可见明显的炎性细胞浸润,药物组可见少量炎性细胞、部分脂肪细胞和增生的血管,温针灸组可见少量炎性细胞散在分布。详见图1。

图1 各组大鼠关节滑膜组织病理学比较(×200)

2.2 各组大鼠血清PGE2含量比较

与正常组比较,其他3组PGE2含量均明显升高,差异有统计学意义(P＜0.01);与模型组比较,温针灸组、药物组 PGE2含量均明显降低,差异有统计学意义(P＜0.05);而温针灸组与药物组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。详见表3。

表3 各组大鼠血清PGE2蛋白含量比较 [M,(P25,P75)]

2.3 各组大鼠滑膜组织Map2k3 mRNA表达

Map2k3 mRNA表达数据资料不符合正态分布,4组组间比较差异无统计学意义(P＞0.05),各组大鼠滑膜组织Map2k3 mRNA表达无显著差别。详见表4。

表4 各组大鼠滑膜组织Map2k3 mRNA表达比较[M,(P25,P75)]

2.4 各组大鼠滑膜组织P53 mRNA表达

与正常组比较,模型组、温针灸组和药物组的大鼠滑膜组织中P53 mRNA均明显升高,差异有统计学意义(P＜0.01);与模型组比较,温针灸组大鼠滑膜组织中P53 mRNA均明显降低,差异有统计学意义(P＜0.05);而温针灸组与药物组,药物组与模型组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。详见表5。

表5 各组大鼠滑膜组织P53 mRNA表达比较 (±s)

表5 各组大鼠滑膜组织P53 mRNA表达比较 (±s)

注:与正常组比较1)P＜0.01;与模型组比较2)P＜0.05

组别 n P53/GAPDH正常组 7 0.03±0.02模型组 7 0.11±0.041)药物组 7 0.08±0.011)温针灸组 7 0.07±0.021)2)

3 讨论

KOA又称为退行性关节炎,是一种多发于中老年人,常累及滑膜、关节软骨和软骨下骨,临床以疼痛和功能活动障碍为主的慢性骨关节疾病。常见的临床表现包括活动时关节的弹响和摩擦音,关节的疼痛肿胀和畸形,关节活动不利和功能障碍。据报道我国 KOA的整体患病率为 8.1%,最高为西南地区的 13.7%, 60岁以上达50%,75岁以上高达80%,患病率随年龄的增长而升高[10-11],KOA的高发病率和高致残率,不仅影响个人生活质量,也造成了一定的社会经济负担。

最近的研究表明 KOA和滑膜炎症关系密切,滑膜对于维持正常的关节活动功能是必需的,它是一种关节内的间充质组织,可以发生于KOA的早、中和晚期各个阶段,发病时的滑膜组织多见滑膜层的增厚,炎性细胞的浸润,弥漫性纤维增生和血管增生等[12-13]。从本次实验研究来看,正常的滑膜平滑光整、色泽淡红,模型组滑膜水肿炎性渗出,色泽呈黄白色,可见明显增生肥厚,镜下可见大量炎性细胞浸润。温针组大鼠经过治疗后滑膜水肿减轻,色泽较模型组有明显改善,镜下炎性细胞数量明显减少,可见温针灸可以减轻 KOA的滑膜炎症。

多种细胞炎性因子参与骨关节炎的发病进程,包括白细胞介素-1、肿瘤坏死因子、一氧化氮、基质金属蛋白酶及 PGE2等,其中 PGE2是花生四烯酸环氧合酶的代谢产物,在骨关节炎关节中通过 COX-2作用生成进而产生促炎致痛作用,参与诸多调节软骨基质降解和关节软骨破坏的过程[14-15]。温针灸可以通过降低KOA大鼠关节液和血清中 PGE2含量[16],这与本研究实验结果一致,模型组中大鼠血清PGE2含量明显高于正常组,进一步证实了 PGE2升高与 KOA的发病有着密切关系。而与模型组比较温针灸治疗可以明显降低大鼠血清PGE2含量,温针灸组与药物组比较无显著差异,说明针灸可以通过降低PGE2表达水平进而起到抗炎的作用。

近年来的研究表明 P53是一种抑癌蛋白,同时也是一种转录因子,在细胞处于应激状态时可被诱导表达,它能够诱导细胞的凋亡,调控炎症反应,同时还具有调控代谢的作用。Zhu X等[17]研究表明在KOA患者中P53蛋白的表达较常人有明显的升高,P53的上调可能会促进KOA发病过程中软骨细胞的凋亡。Bateman JF等[18]研究确认了在鼠类骨关节炎发病中起关键作用的基因包括 Ptgs2、Crlf1、Inhba、Phdla2、Il11、Col10a1、P53、Foxo4和Xbp1等。Narici M等[19]研究表明全膝关节置换术后患者出现的肌肉减少症与P53蛋白的表达密切相关,该基因的有效性可以作为肌肉萎缩的生物标记物。P53 mRNA可能与KOA的发病存在某种联系,其可能是通过调控某种炎症介质作用于某条信号通路来起到抑炎止痛作用,因此本次实验研究选取其作为研究指标,观察温针灸是否能对其表达起到调控作用,结果显示P53 mRNA在模型组、药物组和温针灸组中高表达提示其可能是 KOA大鼠的其中一个致病基因,与模型组相比,温针灸能够明显降低 KOA大鼠滑膜组织P53 mRNA的表达水平。Map2k3属于丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族的特异性蛋白激酶,有研究表明Map2k3 mRNA可能通过作用于p38MAPK信号通路来起到调控骨关节炎的作用,本实验研究结果显示各组间比较 Map2k3差异无统计学意义,可能说明Map2k3 mRNA对骨关节炎调控作用微乎其微。

温针灸治疗大鼠 KOA疗效明确,可以减轻滑膜炎性细胞浸润,减轻滑膜增生水肿,降低 PGE2的含量,抑制P53 mRNA表达来抑制炎性反应,这可能是温针灸防治骨关节炎的作用机制之一。