万安玻璃红鲤鱼PKR的克隆鉴定与系统进化分析[4]

罗 辉，陈 洁，邵 敏，曾 菲，万 力，朱圆玉，胡有生,3

万安玻璃红鲤鱼PKR的克隆鉴定与系统进化分析[4]

罗 辉1，陈 洁1，邵 敏1，曾 菲2，万 力1，朱圆玉1，*胡有生1,3

（1. 井冈山大学医学部，江西，吉安 343009；2.吉安县疾病预防控制中心，江西，吉安县 343100；3.南昌大学抚州医学院，江西，抚州 344000）

本研究以万安玻璃红鲤鱼为材料，通过同源克隆的方法克隆了万安玻璃红鲤鱼双链RNA激活的蛋白激酶(PKRCcvwPKR)，并首次克隆到CcvwPKR的剪接异构体。CcvwPKR全长为2145 bp，编码714个氨基酸，CcvwPKR剪接异构体全长1431 bp，编码476个氨基酸。CcvwPKR的剪接异构体是CcvwPKR第477个密码子的G突变为T（gaa477taa），从而使得CcvwPKR的翻译提前终止。氨基酸序列比对和空间结构SMART预测显示，CcvwPKR和CcvwPKR剪接异构体都含有三个双链RNA结合模体（dsRBM），CcvwPKR剪接异构体缺失PKR的C端的激酶结构域。系统进化分析表明，万安玻璃红鲤鱼PKR在进化上与鲤鱼和鲫鱼密切相关。万安玻璃红鲤鱼和目前已有研究的鲤科鱼类PKR一样，分子结构都含有三个dsRBM，三个dsRBM使得其具有更强的结合dsRNA的作用，推测可能与其较强的抗病能力有关。

万安玻璃红鲤鱼；双链RNA依赖的蛋白激酶; 基因克隆；基因鉴定

双链RNA(dsRNA)依赖的蛋白激酶（PKR），是细胞中重要的dsRNA传感器，能够识别并结合病毒dsRNA，引起抗病毒免疫反应。PKR也可识别并结合细胞在各种刺激作用下产生的内源性的dsRNA，并引起的抗肿瘤免疫反应。PKR结合dsRNA后，发生二聚化活化，活化后的PKR可磷酸化真核细胞初始化因子2α（subunt of eukaryotic intiation factor 2，eIF-2α），从而抑制蛋白翻译的起始，抑制病毒繁殖或引起肿瘤细胞的凋亡[1-2]。

PKR的结构包括N端的dsRNA结合结构域（dsRNA-binding domain，dsRBD），主要介导PKR与dsRNA的结合并引起PKR的二聚化活化，因此其识别和结合dsRNA的能力就直接影响PKR的活化，所以又称为PKR的活性调节结构域；PKR的C端为激酶结构域（Kinase Domain，KD），其主要作用是在dsRBD二聚化牵引下进行二聚化和自磷酸化活化，然后活化的KD可以催化PKR的各种底物磷酸化引发下游信号转导级联反应。如PKR可使eIF-2α磷酸化抑制蛋白翻译的起始，也可以通过NF-κB途径活化转录引起免疫细胞因子的表达。

PKR的N端dsRBD往往由1-3个dsRNA结合模体（dsRBM）串联构成。哺乳动物PKR的N端dsRBD只有2个串联的dsRBMs，即dsRBM1和dsRBM2；少数鱼类含有3个串联的dsRBMs，即dsRBM1、dsRBM2和dsRBM3，如斑马鱼、鲫鱼、牙鲆、草鱼等[3]。其中草鱼PKR的dsRBM1被发现具有典型的dsRBM结构。典型的dsRBM一级结构具有三个高度保守的氨基酸序列，从N端到C端分别是：region1 (NE)、region2 (GPXH)和region3 (KKEAK)序列。其中region3（KKEAK）三个带正电荷的赖氨酸残基在与dsRNA结合中起关键作用。

PKR在脊椎动物各种组织和细胞中都有组成性表达。当受到病毒侵袭或受到干扰素诱导后表达会显著增高，从而引发机体抗病毒免疫反应。鉴于鱼类具有较强的抗病毒免疫功能，研究人员一直在研究其PKR基因并进行克隆和鉴定。2008年，多种鱼类的PKR基因陆续被克隆和报道，如斑马鱼、牙鲆等[3]。本研究对江西吉安万安县特有鱼种万安玻璃红鲤鱼的PKR（CcvwPKR）进行了克隆鉴定。万安玻璃红鲤鱼具有适应范围广泛、抗病能力强、生长速度快、肉质鲜美等特点，是江西省吉安市特色经济鱼种[4]。本研究可为地方特色鱼种基因资源保护和健康养殖奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

本研究使用的万安玻璃红鲤鱼购买于万安县玻璃红鲤鱼原种厂。

1.1.2 试剂与工具酶

大肠杆菌（E.coli）DH5α、质粒pET32a均为本实验室保存。T4 DNA连接酶、XhoⅠ限制性内切酶、EcolⅠ限制性内切酶、KpnⅠ限制性内切酶、Hind Ⅲ限制性内切酶、dNTP、DL2000 Marker、DL5000 Marker、Taq DNA聚合酶均购于TaKaRa公司。十二烷基硫酸钠(SDS)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)，异丙基-6-D硫代半乳糖苷(IPTG)、琼脂糖（Agarose）、无水乙醇、异丙醇、氯化钠、DEPC（焦碳酸二乙酯）、氢氧化钠、无水磷酸二氢钾、氯化钾、氨苄青霉素(Ampicillin)、胰蛋白胨、均购于上海生工生物工程有限公司。Poly I:C购买于美国sigma公司。

1.1.3 试剂盒

SanPrep柱式PCR 产物切胶纯化试剂盒、SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒、SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒均购于上海生工生物工程公司；总RNA提取试剂盒、反转录试剂盒均购于TaKaRa公司；TA克隆试剂盒，购买于北京全式金公司。

1.2 研究方法

1.2.1 引物设计和合成

应用生物信息学技术，在NCBI（https://www.

ncbi.nlm.nih.gov/)基因信息库中检索鲤鱼PKR基因序列然后ORF Finder（http://www.ncbi.nlm.nih.gov

/gorf/gorf.html）分析其基因编码PKR的cDNA开放阅读框ORF，并进行序列比对分析和引物设计。利用在线软件SMART、ORF Finder、ClustalX（http://bips.u-strasbg.fr/fr/Doeumeniation/ClustalX）进行蛋白结构预测分析，分析不同的dsRBM和不同物种的dsRBM 其氨基酸序列保守性规律。根据序列比对结果对万安玻璃红鲤鱼的dsRBM的保守区域进行预测分析，并根据分析结果选择特定区域进行PCR引物设计。

表1 本研究所用到的主要的引物

Table 1 The primary primers applicated in the study

引物名称引物序列（5’to3’）用途 M13FM13RPKR-ORF-FPKR-ORF-RTgt aaa acg acg gcc agtCag gaa aca gct atg accAtg gag tct ttg tcc gggTta gat cgt cct gat gtc ttt at通用引物通用引物PKR ORFPKR ORF

1.2.2 万安玻璃红鲤鱼PKR基因TA的克隆

1.2.3 万安玻璃红鲤鱼PKR基因序列分析

提取万安玻璃红鲤鱼肝总RNA，反转录合成cDNA，使用同源引物扩增CcvwPKR的ORF并构建到pET32a送测序，根据测序结果设计RACE引物，用RACE引物扩增5'和3'端，并用TA克隆方法构建送测序，将 5' RACE 和3' RACE 及ORF测序结果通过 DNAMAN 6.0 软件进行序列拼接，获得万安玻璃红鲤鱼PKR的cDNA 全长。克隆得到的万安玻璃红鲤鱼PKR基因序列的多序列比对和系统进化分析。利用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)检索牙鲆，草鱼、人类、牛、马等14个物种PKR的全长cDNA序列，将得到的PKR氨基酸序列进行SMART空间结构预测，进而获得PKR的N端序列。用ClusatlX软件对这些N端序列进行多序列比对。将序列比对结果的fasta文件用MEGA-X绘制进化树（Neighbor joining tree）。

2 结果与分析

2.1 万安玻璃红鲤鱼PKR及其剪接异构体的碱基序列和氨基酸序列分析

利用同源克隆技术，以鲤鱼PKR为参照设计引物，通过PCR扩增万安玻璃红鲤鱼PKR，将克隆所得基因序列输入NCBI中进行比对，比对结果显示成功克隆出万安玻璃红鲤鱼PKR基因序列及万安玻璃红鲤鱼PKR剪接异构体的基因序列，并由此分别翻译两者的氨基酸序列。如图1所示，万安玻璃红鲤鱼PKR全长2145 bp，编码714个氨基酸残基；万安玻璃红鲤鱼PKR剪接异构体基因序列全长1431 bp，是由万安玻璃红鲤鱼PKR基因序列于第477个密码子发生无义突变，提前终止产生（gaa477taa），编码了476个氨基酸残基。根据所得到的万安玻璃红鲤鱼PKR与其剪接异构体的基因序列比较发现，万安玻璃红鲤鱼PKR基因序列1432G>T突变，导致第477位密码子发生无义突变，即谷氨酸突变为终止密码子，产生了万安玻璃红鲤鱼剪接异构体；蛋白空间结构预测结果表明，克隆所得到的万安玻璃红鲤鱼剪接异构体为万安玻璃红鲤鱼PKR提前终止导致其缺失了C端的KD，也就是说万安玻璃红鲤鱼PKR剪接异构体只含有N端的dsRBD，如图1。

2.2 万安玻璃红鲤鱼PKR蛋白氨基酸序列比对

将万安玻璃红鲤鱼PKR的氨基酸序列与GenBank中14种其他动物（如牙鲆、草鱼、人类、牛、马等）PKR的N端进行序列比对（如图3）。结果发现，万安玻璃红鲤鱼PKR的N端氨基酸序列与鲤鱼的氨基酸序列具有高度相似性。同时，序列比对发现，万安玻璃红鲤鱼PKR的N端和草鱼PKR、鲫鱼PKR、鲤鱼PKR、尼罗罗非鱼PKR及牙鲆PKR的N端比其他PKR的N端氨基酸序列要更长，都含有三个dsRBMs；而每个dsRBM所含有的三个与dsRNA结合密切相关的保守氨基酸序列（NE、GPXH、KKEAK）则有差异。其中鱼类PKR的N端第一个dsRBM的三个保守氨基酸序列一致性更高，而其它动物的dsRBM的三个保守氨基酸序列则一致性较差，特别是第二dsRBM一致性更低，结果如图2。

图中包括万安玻璃红鲤鱼PKR（CcvwPKR）、草鱼PKR（ClPKR）、红鳍东方鲀PKR（TrPKR）、尼罗罗非鱼PKR（OnPKR）、鲤鱼PKR（CcPKR）、鲫鱼PKR（CaPKR）、牙鲆PKR（PoPKR）、三刺鱼PKR（GaPKR）、人类PKR（HsPKR）、黑猩猩PKR（PtPKR）、马PKR（EcPKR）、牛PKR（BtPKR）、小家鼠PKR（MmPKR）、褐家鼠PKR（RnPKR）、野猪PKR（SsPKR）

图2 万安玻璃红鲤鱼及相关物种PKRN端序列比对分析

Fig.2 Sequence alignment of the N-terminal of PKR in CcvwPKR and related species

2.3 万安玻璃红鲤鱼PKR蛋白分子结构的SMART预测

将实验所得万安玻璃红鲤鱼PKR及万安玻璃红鲤鱼PKR剪接异构体的氨基酸序列输入SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）进行蛋白结构预测。结果进一步证实CcvwPKR与其剪接异构体间的区别在于万安玻璃红鲤鱼PKR剪接异构体缺失了C端的KD。CcvwPKR的N端dsRBD中含有3个dsRBMs（dsRBM1：8-74aa；dsRBM2：100-168aa；dsRBM3：213-279aa），这些dsRBMs都含有60～70个氨基酸，与目前相关文献报道一致；且CcvwPKR结构和大多数鲤科鱼类一样，具有3个dsRNA结合模体[5]，如图3和图4。

图3 万安玻璃红鲤鱼PKR蛋白SMART预测结构阈示意图

DSRM为万安玻璃红鲤鱼PKR的3个双链RNA结合结构域，分别是dsRBM1，sRBM2，dsRBM3，标尺显示蛋白各结构对应的氨基酸数量。在标尺为300左右的三个深灰色四边形代表低复杂度区域

Fig4 Schematic diagram of the CcvwPKR transcript variant protein structure predicted by SMART

2.4 万安玻璃红鲤鱼PKR系统进化分析

系统进化分析显示CcvwPKR与鱼类PKR在进化上处于同一分支。进一步分析发现，CcvwPKR与CcPKR位于同一进化分支，说明CcvwPKR和CcPKR两者进化上高度同源，两者在进化上具有密切的关系。另外，CcvwPKR在进化上刚好位于CaPKR和CcPKR之间，说明CcvwPKR在进化上不仅与CcPKR关系密切，而且与CaPKR和CiPKR也有比较近的亲缘关系。相对而言，CcvwPKR与其它鱼类PKR则在进化上关系较远，比如GaPKR、OnPKR、PoPKR和TrPKR等，结果如图5。

用万安玻璃红鲤鱼PKR（CcvwPKR）和草鱼PKR（ClPKR）、红鳍东方鲀PKR（TrPKR）、尼罗罗非鱼PKR（OnPKR）、鲤鱼PKR（CcPKR）、鲫鱼PKR（CaPKR）、牙鲆PKR（PoPKR）、三刺鱼PKR（GaPKR）、人类PKR（HsPKR）、黑猩猩PKR（PtPKR）、马PKR（EcPKR）、牛PKR（BtPKR）、小家鼠PKR（MmPKR）、褐家鼠PKR（RnPKR）、野猪PKR（SsPKR）的氨基酸序列构建PKR家族的进化树，箭头显示的是CcvwPKR

3 讨论

本研究首次克隆CcvwPKR，并进一步克隆到CcvwPKR剪接异构体基因序列。通过对CcvwPKR分析，表明CcvwPKR的dsRBD具有3个dsRNA结合模体（dsRBMs,8-74aa,100-168aa,213-279aa）,这与哺乳动物只有2个dsRNA结合模体不同，但与斑马鱼、鲫鱼、草鱼等鲤科鱼类一致[6]。某些鱼类PKR的N端dsRBD含有三个dsRBM是否具有更强的结合dsRNA作用，从而具有更强调节其C端KD的激活作用，总体上是否具有更强的抗病毒免疫功能？这需要在不同物种的PKR之间进行比较，但目前尚缺乏一个有效比较的细胞分子模型。

CcvwPKR剪接异构体是CcvwPKR的第477号密码子gaa点突变为终止密码子taa，从而使得蛋白翻译提前终止。通过对CcvwPKR剪接异构体蛋白结构进行SAMART预测，结果显示CcvwPKR剪接异构体只含有dsRBD，而缺乏C端的KD。这是第一个被发现缺失激酶结构域的PKR。Dey M.等利用定向删除或突变方法去除PKR的N端后，单独C端仍具有功能[7]。PKR的N端dsRBD被证实具有结合病毒dsRNA的作用，使细胞内可发挥作用的病毒dsRNA量减少，从而抑制病毒的繁殖[8]。dsRBD也可以和细胞在胁迫条件下产生的内源dsRNA结合，活化的PKR可以激活炎性体，导致细胞的凋亡[9]。有研究表明，PKR的N端也能与单链RNA结合，因此推测，PKR可能通过与单链的mRNA结合，从而抑制其翻译模板功能[10]。体外实验证实，缺失KD的PKR的N端也具有结合dsRNA和单链RNA的功能[10-11]。是否缺失KD的CcvwPKR剪接异构体在体内也能结合病毒dsRNA抑制病毒繁殖、结合内源dsRNA激活炎性体、结合单链RNA调控mRNA的蛋白翻译，这些都需要进一步的研究证实。综上所述，CcvwPKR剪接异构体缺失激酶结构域的特点，可能与其存在不依赖激酶活性的抗病毒功能或翻译调控机制有关。

万安玻璃红鲤鱼（Var.）是由鲤鱼演变过来的一个鱼种，在PKR的氨基酸序列比对上两者氨基酸的一致性是92.9%，其中N端的一致率是95.3%，C端的一致率是91.3%，并且CcvwPKR的C端激酶区有一段27个氨基酸序列的插入，说明万安玻璃红鲤鱼从鲤鱼演变过来是一个长期的过程。

万安玻璃红鲤鱼是江西省吉安市万安县的特色鱼种。万安玻璃红鲤鱼除了肉质鲜美，它还具有一定的观赏性，是江西省的特色经济鱼种[4]。因此克隆CcvwPKR，研究其抗病毒免疫功能特点，可为地方特色鱼种基因资源保护和疾病预防提供有用的信息。

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GENE CLONE, IDENTIFICATION AND PHYLOGENETIC ANALYSIS OF PKR FROMVAR.

LUO Hui1，CHEN Jie1，SHAO Min1，ZENG Fei2，WAN Li1，ZHU Yuan-yu1，*HU You-sheng1,3

2. School of Medicine, Jinggangshan University, Ji’an, Jiangxi 343009, China; Center for Disease Control and Prevention of Ji’an xian , Jiang xi, 343100, China;3. Fuzhou Medical College, Nanchang University, Fuzhou, Jiangxi 344000, China）

In this study, PKR (CcvwPKR) fromvar.was cloned by homologous clone methods, and CcvwPKR transcript variant was cloned for the first time. The full-length of CcvwPKR was 2145 bp, coded 714 amino acids, and the full-length of CcvwPKR transcript variant was 1431 bp, coded 476 amino acids. The translation of CcvwPKR transcript variant was terminated ahead of CcvwPKR at codon 477 with a point mutation G to T (gaa477taa). Amino acids sequences alignment and protein space structures prediction by SMART indicated that they all harbored three dsRBMs. Furthermore, the C terminal kinase domain of CcvwPKR transcript variant was deleted at codon 477 with point mutation. Phylogenetic analysis indicated that CcvwPKR was closely related to common carp and crucian carp. Consistent with the studied PKR of other cyprinidae fishes, they all had three dsRBMs, it implied that they had stronger ability of dsRNA binding and robust antiviral features.

var.; PKR; gene clone; gene identification

168085（2021）06-0035-06

Q785

A

10.3669/j.issn.1674-8085.2021.06.007

2021-07-30；

2021-09-08

国家自然科学基金项目(31560595)；井冈山大学博士科研启动项目(2019)；井冈山大学2020年校级大学生创新创业训练项目(214)；井冈山大学2021年省级大学生创新创业训练计划项目（80）

罗 辉(1971-)，男，江西吉水人，副教授，硕士，主要从事生物化学与分子生物学研究(E-mail: luohui9898@163.com)；

陈 洁(2001-)，江西赣州人，女，井冈山大学医学部预防医学专业2018级本科生(E-mail:1656063927@qq.com)；

邵 敏(2000-)，女，贵州盘州人，井冈山大学医学部预防医学专业2017级本科生(E-mail:1985173904@qq.com)；

曾 菲(1997-)，女，江西吉水人，主要从事疾病预防控制研究(E-mail:1031281322@qq.com)；

万 力(2000-)，男，江西抚州人，井冈山大学医学部临床医学专业2019级本科生(E-mail:1401288775@qq.com)；

朱圆玉(1999-)，女，江西萍乡人，井冈山大学医学部药学专业2018级本科生(E-mail:11253844678@qq.com)；

*胡有生(1968-)，男，江西吉水人，副教授，博士，主要从事分子免疫学研究(E-mail:huyousheng68@163.com).