siRNA 干扰牦牛Bmal1 基因对颗粒细胞激素分泌的影响

2021-03-01赵明旺徐尚荣张琳钦

中国畜牧杂志 2021年2期

赵明旺，张君，徐尚荣，黄荣，舒适，彭巍，张琳钦

（1.青海大学农牧学院，青海西宁 810016；2.青海大学畜牧兽医科学院，青海西宁 810016）

牦牛是高原地区的全能家畜[1]。在我国，牦牛的需求量大，市场广泛，牦牛养殖业是高原畜牧业经济和西北地区农业生产中不可或缺的组成部分，但受环境等因素影响，牦牛的繁殖能力普遍不高。因此，提高牦牛的繁殖力有助于牦牛产业的发展。

作为生物钟家族的核心成员之一，Bmal1（Brain and muscle arnt-like 1）主要以异源二聚体的形式在哺乳动物生物钟转录、翻译反馈环中起到正调节的作用[2]。研究发现，Bmal1基因能参与哺乳动物生殖生理的调控[3-4]。有研究表明，敲低颗粒细胞Bmal1 可显著降低动物COX2 的表达，从而影响前列腺素的合成[5-6]；Alvarez 等[7]研究发现敲除Bmal1基因后，雌雄小鼠不仅出现不孕不育现象，而且孕激素合成的重要调节蛋白（Star）功能出现降低，导致小鼠类固醇激素合成及分泌减少，影响雌雄鼠的生殖能力。Cyp19a1是雌激素合成的关键基因，参与性激素的合成[8]；Star作为类固醇激素合成的限速酶，主要负责编码的蛋白能够将线粒体外膜的胆固醇转运到线粒体内膜，Star基因是类固醇激素合成的重要基因[9]。关于Bmal1基因的表达对牛繁殖生理的影响鲜有报道。因此，本实验以体外培养的牦牛卵巢颗粒细胞作为研究对象，用siRNA 干扰Bmal1基因的表达，探讨抑制Bmal1基因表达是否对牦牛颗粒细胞激素分泌有所影响，以期为阐明Bmal1基因参与牦牛卵泡发育的分子机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物西宁市裕泰屠宰场母牦牛。

1.1.2 主要试剂 DMEM、10% 胎牛血清购于Gibico公司；TransZol Up Plus RNA Kit 和蛋白提取试剂盒购自北京全式金生物公司；反转录试剂盒、TB GreenTMPremix Ex TaqTM购自大连宝TaKaRa 生物工程有限公司；siRNA-Mate 转染试剂购自上海吉玛制药技术有限公司；ELISA 试剂盒购自江苏酶标生物科技有限公司；BMAL1 和GAPDH 抗体购自Abcam 公司；CYP19A1和STAR 抗体购自北京博奥森生物技术有限公司。

1.1.3 主要仪器 CO2培养箱为美国Thermo 产品；qRTPCR 仪为Applied Biosystems 产品；多功能酶标仪为Biotek 产品；蛋白电泳仪为Bio-rad 产品；多功能化学发光仪为Proteinsimple 产品。

1.2 牦牛颗粒细胞的体外分离与培养

1.2.1 牦牛颗粒细胞的体外分离采集健康牦牛的卵巢置于盛有36℃生理盐水及双抗的保温杯中，在2～6 h 内送回实验室细胞间。剪掉卵巢上的结缔组织，将卵巢用生理盐水清洗3 次。用10 mL 注射器吸取卵泡液于盛有2 mL 5%胎牛血清（FBS）的15 mL 离心管中，常温离心5 min（1 200 r/min），弃去上清液，PBS 离心清洗5 次。用细胞筛过滤，得到较为纯净的牦牛颗粒细胞。

1.2.2 牦牛颗粒细胞的体外培养将收集好的牦牛颗粒细胞按照4×105/mL 接种于含10%胎牛血清（FBS）的DMEM 基础培养基，分别装入细胞瓶中培养。24 h 后观察细胞生长情况，弃掉原培养基，用PBS 清洗3 遍，再换上新的培养基继续培养。48 h 后，细胞长满瓶底时，将细胞传代至6 孔板中，细胞量为1.5×105个/孔，然后在37℃，5% CO2培养箱中培养。

1.3 Bmal1 siRNA 细胞转染培养20 h，待细胞长至30%～50%时，对细胞进行转染。①将200 μL 无血清培养基加入无菌EP 管中，再加入6 μL Bmal1 siRNA 或Bmal1 siRNA NC（Negative Control）；②每管加入10 μL siRNA-Mate，充分混匀，室温静置10 min；③给6 孔板每孔换上2 mL 预热的新鲜培养基；④将静置完毕的转染混合物分别加入孔中，然后在37℃、5% CO2培养箱中培养。对照组和实验组各设置3 个复孔。

siRNA 干扰片段带有荧光标记染色，当将其对体外培养的卵巢颗粒细胞进行转染6 h 后，弃去细胞培养基，轻轻地使用PBS 吹吸细胞3 次，然后在荧光显微镜下检测转染效率。

1.4 引物设计与合成根据NCBI 数据库已知牦牛各基因序列，利用Oligo7.0 软件分别设计Bmal1、激素合成相关基因Cyp19a1和Star，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；Bmal1基因干扰片段由上海吉玛制药技术有限公司设计合成。引物序列如表1。

1.5 总RNA 提取及cDNA 的合成弃去细胞培养液，PBS 清洗2 遍后，用TransZol Up Plus RNA Kit 对细胞的总RNA 进行提取，经测定各组RNA 浓度及纯度后，每组按700 ng 的量进行反转录。反转录按照试剂盒PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit 说明书进行。cDNA 置于-20℃保存备用。

1.6 ELISA 检测细胞培养基中雌二醇（E2）和孕酮（P4）含量细胞转染72 h 后，收集各组的细胞培养液，参照ELISA 试剂盒说明书分别检测E2和P4含量。

1.7 qRT-PCR 反应按照试剂盒（TB GreenTMPremix Ex TaqTM）说明书进行，体系为20 μL：Premix 10 μL，Dye 0.4 μL，ddH2O 6 μL，上、下游引物各0.8 μL、DNA 模板2 μL；退火温度为59℃。反应程序：95℃预变性30 s，95℃变性5 s，60℃退火延伸34 s，共35 个循环。每组实验样品进行3 次重复，每个样品的目的基因和内参基因GAPDH分管同板以相同条件扩增。

1.8 Western blot

1.8.1 总蛋白的提取在利用si-Bmal1 进行干扰处理72 h后，将对照组和实验组的颗粒细胞进行总蛋白提取。将转染后的细胞消化收集后，用PBS 离心清洗（700 r/min），弃掉上清液；向细胞沉淀加入1 mL TPEB，然后剧烈震荡15 s，冰上孵育30 min；最后14 000 r/min 离心10 min，小心收集上清液，得到的总蛋白置于-80℃保存备用。

表1 引物序列

1.8.2 Western blot 将变性后的蛋白通过SDS-PAGE（8%分离胶）分离；电泳结束后，利用PVDF 膜将蛋白转印到膜上；转膜结束后，5%脱脂牛奶37℃封闭3 h；将按一定的比例稀释后的一抗：BMAL1（1:2500）；CYP19A1（1:500）；STAR（1:600）；GAPDH（1:3 000），与PVDF 膜4 ℃冰箱过夜孵育；将PVDF 膜取出，TBST 清洗1 h，然后室温孵育二抗2 h；将PVDF 膜取出，用TBST 在37℃环境下清洗2 h；配置适量的发光液，加到PVDF 膜上反应2 min 左右，最后曝光仪器上曝光并拍照。每组实验样品进行3 次重复。

1.9 统计分析根据Ct 值，采用2-△△Ct法，计算不同基因的相对表达量。Western blot 结果Alpha View SA软件进行计算蛋白相对表达量。用IBM SPSS Statistics 19.0 统计软件进行数据分析，组内差异进行t检验，同组不同时间点的数据用单因素方差分析。所有数据以均数±标准差表示。*表示差异性显著（P＜0.05），**表示差异性极显著（P＜0.01）。

2 结果与分析

2.1 siRNA 转染和干扰效率的检测转染6 h 后，在荧光显微镜下检测转染效率。如图1 所示，经过带有荧光标记的siRNA 转染后，在超过80%的细胞中都能观察到绿色的荧光信号，表明siRNA 的转染效率可达到80%以上，合成的干扰片段可用于后期实验。

图1 Bmal1 siRNA 转染效果

将牦牛卵巢颗粒细胞进行分组，用si-Bmal1和阴性对照NC 进行转染，48 h 后提取细胞RNA，应用qPCR 检测si-Bmal1干扰效率。如图2 所示，si-Bmal1mRNA 相对表达量与对照组相比极显著下调，干扰效率大于50%，si-Bmal1干扰片段可用于后期实验。

图2 Bmal1 siRNA 的干扰效率

2.3 ELISA 检测细胞培养基中E2和P4含量在使用si-Bmal1对体外培养的牦牛卵巢颗粒细胞进行转染72 h后，测定细胞培养液中的激素浓度。如图3 所示，在siRNA 干扰Bmal1后，E2（P＜0.05）和P4（P＜0.01）浓度低于对照组。

图3 干扰Bmal1 表达对颗粒细胞激素分泌的影响

2.4 siRNA 干扰Bmal1对激素分泌基因表达的影响在使用si-Bmal1干扰处理72 h 后，用qPCR 检测对照组和实验组的颗粒细胞激素合成相关基因Cyp19a1和Star的表达。如图4 所示，使用siRNA 进行干扰后，Cyp19a1和Star的表达下降；其中，Cyp19a1的表达相对于对照组下调极显著。

图4 干扰Bmal1 对Cyp19a1 和Star 表达的影响

2.5 siRNA 干扰Bmal1对激素分泌相关蛋白表达的影响用Western blot 检测BMAL1 蛋白、E2 合成相关蛋白CYP19A1 以及孕酮合成的相关基因STAR 的表达。如图5 所示，siRNA 片段可以降低BMAL1 蛋白的表达（P＜0.01），同时CYP19A1 蛋白表达也在抑制Bmal1后降低（P＜0.05），STAR 的降低趋势不显著。

图5 干扰Bmal1 对BMAL1、CYP19A1 和STAR 表达的影响

3 讨论

作为卵泡重要细胞之一，颗粒细胞在多种激素和信号分子的作用之下增殖和分化，进而影响卵泡的发育和成熟[10]。在哺乳动物卵巢中，颗粒细胞分泌的E2和P4可以促进卵泡的发育、成熟和排卵，对卵巢生长有着重要意义[11-12]。此外，颗粒细胞在发育过程中通过多条信号通路（如mTOR 信号通路和cAMP 信号通路等）与卵母细胞之间相互作用，而且这些信号通路之间同样存在相互影响的关系，最终决定卵泡的成熟或闭锁[13-14]。赵明旺等[15]研究发现，牦牛颗粒细胞中存在Bmal1基因的表达。因此，本研究以体外牦牛卵巢颗粒细胞作为研究对象，应用siRNA 干扰颗粒细胞细胞Bmal1基因的表达，探究Bmal1基因对牦牛卵泡发育功能的影响。

生物钟基因参与调控雌性动物下丘脑-垂体-性腺轴（HPG），从而影响雌性动物的生殖代谢活动[16-17]。Chu 等[18]研究发现，Bmal1基因的昼夜节律性表达对大鼠颗粒细胞和黄体细胞的生长有影响，敲低Bmal1基因的表达不仅破坏了其表达的节律性，而且颗粒细胞和黄体细胞的凋亡水平显著增加。在激素分泌及合成方面，动物卵巢激素受体以及合成基因的编码区上游被证实存在着生物钟调控元件E-box、RORE 和 D-box 的序列，表明卵巢关键功能基因启动子区域中的这些调控元件可能在生物钟系统的作用下发挥调控激素分泌的作用[19]。Zhang 等[20]研究发现，人类卵巢颗粒细胞中的Bmal1和Sirt1基因敲除后，颗粒细胞的雌激素分泌下降，并且雌激素合成相关芳香化酶的表达也减弱，而细胞中Bmal1和Sirt1基因过表达处理后则相反；该研究表明Bmal1基因参与卵巢颗粒细胞雌激素的分泌。也有研究指出，Bmal1基因的缺失或突变能够下调类固醇急性调节蛋白的表达量，抑制卵巢颗粒细胞孕酮的分泌[6,21-22]。Chu等[23]敲除小鼠颗粒细胞中的Bmal1基因，导致Lepr、Cyp19a1和Cyp11a1的表达出现下调，而且E2分泌量下降。Wang 等[22]研究指出生物钟基因的缺失能影响Star基因的表达，使得P4的合成受到影响。本研究应用ELISA 检测得出干扰Bmal1基因的表达后颗粒细胞培养基中E2和P4的分泌量下降，并且最后通过mRNA 和蛋白水平检测了激素分泌相关基因的表达在干扰Bmal1基因的表达后都降低，这说明Bmal1基因参与牦牛卵巢激素合成的调节。在对激素合成蛋白表达量检测结果发现，干扰Bmal1基因表达后，Cyp19a1 蛋白的表达并没有像其mRNA 一样被显著性下调；而Star 蛋白下调不显著，推测下调Bmal1基因后对Cyp19a1和Star基因翻译成相应蛋白的过程干扰程度减弱，具体机制还需要进一步探究。本研究结果表明，Bmal1基因参与调控牦牛卵巢颗粒细胞分泌雌激素和P4。这为进一步研究Bmal1基因在牦牛颗粒细胞的生长作用的调节提供一定的理论依据。