梯棱羊肚菌单孢分离、交配型基因鉴定及其菌丝融合杂交研究

贺国强

（北京市农业技术推广站，北京 100029）

梯棱羊肚菌（Morchella importuna）属于子囊菌门（Ascomycota）、盘菌亚门（Pezizomycotina）、盘菌纲（Pezizomycetes）、盘菌目（Pezizales）、羊肚菌科（Morchellaceae）、羊肚菌属（MorchellaDill.Ex Pers.：Fr.），是一类珍稀野生的名贵食用菌。羊肚菌的驯化栽培吸引着大批蘑菇爱好者投身其中。目前羊肚菌室内栽培和室外大田栽培模式均取得了一定成功，对于羊肚菌产业化具有重要意义[1-3]。自2012年我国羊肚菌进入了产业化时期，种植面积由最初的200hm2，迅速增长到了4667hm2左右。但羊肚菌属于子囊菌，菌种易退化，加之其生理及遗传研究基础薄弱，造成了羊肚菌栽培的不稳定性，无法稳定盈利，限制着羊肚菌产业的健康和稳定发展。

目前羊肚菌栽培的菌株普遍采用组织分离的方法获得，但随着组织分离、转代次数的增加等因素影响，会导致菌株中的其中一种交配型基因逐渐减少或衰退，造成减产或无法出菇[4-5]。因此，建立羊肚菌的单孢杂交育种方法对于羊肚菌品种选育至关重要。不同于担子菌的杂交育种通常以单孢之间拮抗线处的锁状联合作为标记，属于子囊菌的羊肚菌菌丝没有明显的锁状结合，需要另外特定的标记以确定是否杂交成功。真菌的交配型基因是控制性发育的1 个基因簇位点。子囊菌中通常含有2 种类型的交配型位点即Mat1-1 和Mat1-2，如果2 个交配型位点位于同1 个细胞核内，即可在分子层面认定为同宗结合真菌；反之如果分布在不同的细胞核上，则被认定为异宗结合真菌，交配型位点的序列没有同源性，但调节着近等的功能，位点两侧有保守的基因序列，因此称为idiomphom[6-8]。近年来通过对交配型基因（Mat1-1或Mat1-2）的研究，认为目前已被驯化栽培的梯棱羊肚菌（M.importuna）和六妹羊肚菌为异宗结合真菌，梯棱羊肚菌的子囊孢子虽为多核体，但为同核体[9]。基因组数据也表明，梯棱羊肚菌的交配型基因是单拷贝基因[6，10-11]，可以直接将其作为1 种共显性核型标记使用。

收集梯棱羊肚菌亲本菌株（F0）的单孢群体（F1），利用显微操作法分离获得单孢菌株，并对F1单孢群体交配型进行测定，随后对F1群体间进行实验室条件下的随机配对杂交，获得Fx菌株，以期为羊肚菌育种工作提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试菌株梯棱羊肚菌栽培菌株M-15、M-CY、M-HM（F0亲本菌株）源自商业化栽培菌株和野生驯化菌株，保存于北京市农业技术推广站食用菌实验室。采用形态学特征结合ITS 序列分析确证是梯棱羊肚菌。利用自然弹射法收集羊肚菌的子囊孢子。

1.2 单孢分离及纯化采用显微操作技术分离羊肚菌单个子囊孢子。首先采用50%的无菌甘油溶液将孢子稀释至100 万个/mL，取50μL 涂布于无菌载玻片，将载玻片置于倒置相差显微镜；用拉针仪或手工制备挑针，将做好的毛细管挑针拿在操作手臂上，缓慢将挑针移动至显微镜视野内，在视野下用毛细管挑针吸住分散的单个子囊孢子，抬针，将吸取的子囊孢子在无菌操作环境下转移（小洗耳球吹出）至CYM 完全培养基（酵母粉2g/L、蛋白胨2g/L、K2HPO41g/L、MgSO40.5g/L、KH2PO40.46g/L、葡萄糖20g/L、琼脂20g/L，加无菌水至1L）平板，置于23℃避光培养，约36～48h 可见萌发形成的单菌落。肉眼观察平皿内菌丝，并使用显微镜进行观察，若明显由一个子囊孢子萌发形成辐射状菌丝，基本可视为单孢菌株。无菌操作及时切取菌丝生长末端的单根菌丝，转接至新的培养基内，即获得纯化的单孢菌丝。单孢群体F1编号为F1（M）n，M 表示亲本菌株名称，n 为数字编号，代表第n 个单孢。

1.3 交配型基因的测定DNA 的提取中，F0亲本菌株、F1单孢群体均为纯培养的菌丝体。菌丝体或组织块经液氮研磨后，用裂解液（CTAB 2%、PVP 2%、Tris-HCl 100mmol/L、EDTA 20mmol/L、NaCl 1.4mol/L）裂解获得DNA 粗提液，经V（苯酚）∶V（氯仿）∶V（异戊醇）=25∶24∶1 去蛋白后再经乙醇沉淀、RNAase 消解去除RNA 污染，最终获得纯净DNA，稀释至50ng/μL，4℃储存备用。

交配型基因的扩增引物为MAT1、MAT2[10]，P8-4、P6-1[12]，PLiu1、PLiu2。其中引物对MAT1F/R、P8-4F/P8-4R、PLiu1F/R 用于检测交配型MAT1-1-1，引物对MAT2F/R、P6-1F/P6-1R、PLiu2F/R 用于检测交配型MAT1-2-1。P8-4F 的核苷酸序列为5′-GCTCTCTTGTGCCCCTTTTGACTAT-3′，P8-4R 的核苷酸序列为5′-TCTACCAGCCATGTGAAAC AAGCAA-3′；P6-1F 的核苷酸序列为5′-GAGA CTCAAATCTGACTGACTTCCT-3′，P6-1R 的核苷酸序列为5′-GAAGAACCTCAGATAAGCGTAAAAT-3′。扩增的目的片段大小分别为1837bp 和1740bp，分别代表MAT1-1-1和MAT1-2-1交配型基因序列全长。25μL 扩增体系包括2×PCRmix（TSINGKE Bio Inc）12.5μL，10μmol/L 的P8-4F、P8-4R 引物各1μL，DNA 模板1μL，ddH2O 9.5μL。PCR 扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸90s，30 个循环；72℃延伸10min。所有扩增产物在1.2%（W/V）琼脂糖凝胶上电泳检测。

1.4 F1 单孢群体菌丝生长特性测定直接用肉眼观察菌落特征，主要包括菌丝生长整齐度、颜色、菌核数量。菌丝日均长速的测定：当菌丝体培养到第N 天（96h）时（以菌丝将近长满平皿而未长满平皿时作为测量终点），以接种块为中心用刻度尺测量菌落直径（mm），随机测量4 次，取平均值。菌丝日均长速的计算方法：菌丝日均长速（mm/d）=Y（菌落直径-8mm）÷2÷培养天数（d）。最后取5 个重复的平均值。

1.5 F1 单孢群体平皿内融合按照Volk 等[13]的单孢融合方法，将基因型分别为MAT1-1-1和MAT1-2-1型的单孢分为一组。在90mm 直径的PDA平板内均分4 个区，分别从MAT1-1-1和MAT1-2-1型组单孢选出2 个单孢菌丝，不同交配型基因按对角线均等排列（为了减少平皿个数），菌丝块圆柱体的直径约0.5cm，菌丝块之间的距离约为4cm。将接种好的各单孢子菌株继续于25℃恒温培养，至菌丝体长至两两之间相互交汇，观察现象并记录。

1.6 杂交融合Fx 菌株的筛选、鉴定从菌丝交汇处隆起部位挑取0.2cm×0.2cm 接种于新的PDA平皿内，25℃恒温培养，然后检测其交配型基因类型，若同时含有MAT1-1-1和MAT1-2-1型基因，则可能是杂交融合子。将同时含有MAT1-1-1和MAT1-2-1型基因的疑似融合菌株与相应的亲本F1单孢菌株接种于同一个PDA 平皿内，观察其有无拮抗线，若疑似融合菌株与相应的亲本F1单孢菌株两两间都有拮抗线存在，则表明杂交成功。

2 结果与分析

2.1 单孢分离及纯化待单孢菌丝刚刚萌发时，挑取单根菌丝，接种于新的CYM 平板，编号，进行培养。共挑取399 个单孢，萌发获得并纯化得到141个单孢菌株，成功率35.34%。3 个亲本菌株的F1单孢挑取成功率差别较大（表1），F1（M-CY）的单孢挑取成功率最低，仅为26.92%；F1（M-15）、F1（M-HM）的单孢挑取成功率较高，均达到40%以上，可能与各亲本菌株的F1单孢的活力有关，从而直接影响了单孢的萌发率，进而影响了单孢挑取的成功率。

表1 显微操作法挑取单孢的成功率统计

2.2 F1 单孢群体菌丝生理特性由表2 可知，同一亲本获得的单孢群体，在菌丝生长、产生色素方面存在差别。F1（M-15）有1 株单孢产黄褐色素，F1（M-CY）有3 株单孢产黄褐色素，F1（M-HM）无单孢产黄褐色素，但有17 株单孢产灰褐色素。综合来看，不产色素的菌株最多，占比84.8%，产黄褐色素的菌株占比2.9%，产灰褐色素的菌株占比12.3%。

表2 基于PDA 上的培养特征的单孢菌株分组

由表3 可知，同一亲本获得的单孢群体，单孢的生长速率差别也很大。F1（M-CY）的最小生长速率值最小，为0.85cm/d，F1（M-HM）的最大生长速率值最大，为1.93cm/d，而3 个单孢菌株的平均生长速率相差不大，分别为1.49cm/d、1.46cm/d、1.53cm/d。

表3 单孢菌丝生长速率 （cm/d）

2.3 F1 单孢群体的分型不同引物对的特异性存在较大差别。由表4 可知，相比较使用MAT1F/R、MAT2F/R 引物对，利用P8-4F/P8-4R、P6-1F/P6-1R 引物对可以较好地扩增出MAT1-1-1、MAT1-2-1基因，用于区分出单孢的交配型基因类型，检出率达87.5%，基本与使用PLiu1F/R、PLiu2F/R引物对结果一致，因此，采用P8-4F/P8-4R、P6-1F/P6-1R 引物对扩增交配型基因。

利用改进的特性引物（P8-4F/P8-4R、P6-1F/P6-1R）进行PCR 扩增，检测单孢菌株的交配型基因。由表5 可知，共完成93 株单孢菌株的交配型基因分型，经统计分析，MAT1-1-1与MAT1-2-1型单孢菌株数分别为37 株和51 株，比例为0.73∶1。其中F1（M-15）、F1（M-CY）、F1（M-HM）基因型为MAT1-1-1型的菌株数分别为15 株、14 株、8 株，基因型为MAT1-2-1型的菌株数分别为22 株、15 株、14 株。仅有F1（M-CY）中1 株菌株未检测出交配型基因类型。F1（M-15）中4 株菌株同时检测出两种交配型基因类型，重复试验结果依然如此，可能这4 株菌株为混合孢子，非单孢。

表4 不同引物对单孢菌株的交配型基因的检出统计

表5 单孢菌株的交配型基因分型统计

2.4 单孢菌株间融合表现将已鉴定的不同交配型基因单孢菌株接种于同一平板，使菌丝接触，发生融合。初步共完成配对408 个组合。挑取不同交配型基因单孢接触的融合带，接种于新的PDA 平板，待菌丝刚萌发，挑取单根菌丝。由表6 可以看出，菌株之间两两生长接触，表现出3 种融合类型：（1）有融合带（隆起），无色素；（2）有融合带（隆起），产生褐色素；（3）无融合带，两菌株菌丝互相渗透生长。其中第2 种融合类型最多，占比43.4%，第3 种融合类型最少，占比仅为16.9%。

表6 不同交配型单孢菌株的平皿杂交统计

2.5 单孢融合菌株的鉴定将挑取的融合菌株，分别与母本进行拮抗试验，与亲本菌株都存在拮抗的菌株可能是杂交菌株。将与亲本菌株都存在拮抗的融合带菌株进行PCR，测序，鉴定交配型基因类型。鉴定出F1（M-CY）2×F1（M-15）8 同时含有MAT1-1-1型和MAT1-2-1型基因，为融合子。

3 结论与讨论

采用显微操作技术从3 株梯棱羊肚菌栽培菌株（F0）的子囊孢子群体（F1）中分离出单个孢子，进而获得单孢菌株，并且单孢分离效率较高，达35.34%。显微单孢分离技术尤其适合孢子较大的羊肚菌，单孢分离成功率较稀释涂布法高。羊肚菌的子囊孢子较大，约十几个微米，且识别度高，便于进行显微操作。此外，相较于稀释涂布法分离单孢，显微操作在稀释倍数合适的情况下，即每个视野内2～3 个单孢，可以较好地排除两个或多个子囊孢子的粘连（稀释法易发生），确保分离得到的是单个孢子。F1单孢群体交配型基因分型结果表明，在随机挑选的93 株单孢分离菌株中，交配型基因分型仅有4 株菌株同时检测出两种交配型基因类型，可能这4 株菌株为混合孢子，相较于一般的稀释法（成功率小于30%）单孢挑取分离成功率很高。

F1单孢群体的菌丝生理特性研究表明，不同单孢的菌丝生长速率差别较大，最小的生长速率和最大的生长速率可相差1 倍。主要是由于子囊孢子是先经过减数分裂，而后再进行一次有丝分裂形成的，基因出现了随机组合，一个子囊内的8 个子囊孢子有4 种基因型，而由于存在多个基因位点，理论上减数分裂得到的子囊孢子的基因型都不完全相同[14]。因此，分离到的单孢间可能存在差异，表现在菌丝生长速率、菌丝形态、产生色素等方面。

不同交配型基因扩增引物对的特异性存在较大差别。不同于Du 等[10]使用扩增引物MAT1F/R、MAT2F/R 对14 株黑色羊肚菌进行交配型基因的分型，本研究利用P8-4F/P8-4R、P6-1F/P6-1R 引物对可以扩增出MAT1-1-1、MAT1-2-1基因，较好地区分出单孢的交配型基因类型，检出率达87.5%。这可能与引物与交配型基因的DNA 序列结合的特异性有关。

基于交配型基因的单孢分型，尤其适合于遗传背景不完备、基因标记缺乏的子囊菌的遗传标记。本研究中，不同交配型的F1单孢平皿配对试验，成功筛选出1 个杂交子，为羊肚菌单孢杂交育种工作奠定了基础。但在平皿内进行单孢杂交，仅仅依靠交配型基因标记难度较大，如何判断杂交融合成功、如何有效筛选是难点。现有的基于拮抗反应和交配型基因的PCR 法，工作量大；而且基于交配型基因的融合观察，存在拮抗的干扰；同时挑取融合带中融合菌丝，存在亲本菌丝的干扰，难度较大，效果依然不太理想。因此，需进一步研究有效的筛选标记以提高筛选效率。