内生真菌诱导子对火木层孔菌次级代谢的影响

纪红燕，吴佳妮，吴欣圆，吴秀丽，何 娜，刘 成*(.宁夏医科大学总医院药剂科，银川 750004；.宁夏医科大学科学技术研究中心，银川 750004；.银川知微生物科技有限公司，银川 750004)

桑黄(Phellinusigniarius)为多年生药用真菌，《神农本草经》中称其为桑耳，是国际公认的抗癌效果较好的大型药用真菌[1-2]。前期在其子实体中发现具有抗氧化、抗肿瘤等作用的生物活性物质hispidin衍生物[3-6]。由于野生桑黄资源有限，为了寻找替代资源，前期对桑黄的基原菌种火木层孔菌的次级代谢产物进行了深入研究[7]，但并未分离得到hispidin衍生物等成分。研究发现，对菌株发酵过程进行适当地诱导调控，有利于提高活性成分的含量[8-10]。而内生真菌能够产生一类可诱导药用植物细胞生物合成次生代谢产物的物质，称为内生真菌诱导子，属于外源性诱导子[11-12]。因此，本研究利用野生桑黄子实体中的内生真菌对火木层孔菌菌株的发酵过程进行诱导调控，以hispidin衍生物等成分作为对照，初步考察内生真菌诱变对菌株次级代谢产物的影响，为药用真菌桑黄的有效开发和野生资源替代提供依据。

1 仪器与材料

1.1仪器 SW-CJ-2FD型超净工作台(苏净集团苏州安泰空气技术有限公司)；Thermo Forma 311型CO2细胞培养箱(美国Thermal公司)；SPX-250-GB型智能光照培养箱(上海龙跃仪器设备有限公司)；HYG-A型全温摇瓶柜(常州金坛精达仪器制造有限公司)；高倍倒置光学显微镜-连接照相装置(CCD)(日本Olympus公司)；RE-52型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；YM75A型高压蒸汽灭菌锅(上海三申医疗器械有限公司)；Hitachi S-3400N型扫描电镜(美国EMS公司)。

1.2试药 液体发酵培养基(商用马丁培养基，青岛高科技工业园海博生物技术有限公司)。

1.3菌种 火木层孔菌(Phellinusigniarius)由中国医学科学院药物研究所生物合成室戴均贵研究室提供；菌源购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC 5.95)。

2 方法

2.1内生真菌的分离与纯化 取表面彻底清洁后的野生桑黄子实体在超净工作台中切成0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的小块，子实体小块的表面先用10 mL·L-1次氯酸钠消毒，再用无菌水冲洗以去除子实体表面的次氯酸钠残留物，反复3次，继而采用体积分数为75%的乙醇消毒，并用无菌水冲洗，各3次。用灭菌后的刀片将经彻底消毒的组织切成直径约为0.5 cm的薄片放入马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar medium with antibiotics，PDA)培养基中(马铃薯200 g·L-1，葡萄糖的质量浓度为20 g·L-1，琼脂的质量浓度为20 g·L-1，青霉素的质量浓度为0.05 g·L-1，蒸馏水1 L)。置于28 ℃避光培养3～7 d，待内生真菌的菌丝长出后，采用反复划线法进行纯化并命名保存，待用。

2.2内生真菌的扫描电镜显微观察 将真菌菌株接种于改良马丁固体培养基，将经灭菌处理的盖玻片以45°夹角插入菌落生长的培养基中，培养2 d后，将盖玻片轻轻拔出，用0.1 mol·L-1的二甲砷酸钠缓冲液快速冲洗2次，放入2.0 mL·L-1戊二醛溶液中固定2 h(有菌丝的一面朝上)。固定后，用0.1 mol·L-1二甲砷酸钠缓冲液冲洗3次(间隔2 h更换缓冲液1次)，最后用0.1 mol·L-1二甲砷酸钠缓冲液于4 ℃条件下固定12 h以上，依次用体积分数为30%、50%、70%、80%、90%的乙醇及乙醇脱水，每次脱水时间为10～15 min。用体积分数为95%的叔丁醇溶液置换2次，每次15 min，再用100%的叔丁醇溶液置换15 min，置换完毕后将样品放置于-20 ℃冰箱中预冷20 min。经冷冻干燥处理，离子溅射仪喷镀后，将制做好的样品，放置于扫描电镜下，在10 kV下观察菌株的形态。

2.3生物诱导子对火木层孔菌的诱导过程

2.3.1火木层孔菌生长曲线测定 将活化好的火木层孔菌接种于真菌培养基中，于28 ℃以180 r·min-1振荡培养，隔天取样，培养至第20天。减压抽滤真菌培养液，得到菌丝体，于60 ℃烘干后称质量。以培养时间(t)为横坐标、菌丝体干质量(g)为纵坐标，绘制火木层孔菌的生长曲线。

2.3.2生物诱导子的制备及诱导过程 挑取经纯化的桑黄内生真菌菌丝体放入PDA液体培养基(去除琼脂)中进行发酵培养，于28 ℃以180 r·min-1振荡培养5 d。培养完成后分别将菌丝体与菌液分离(减压抽滤)，反复用蒸馏水洗涤菌丝体3次，除去水分后转移菌丝体至组织匀浆机中，制备菌丝体匀浆。取制备好的菌丝体匀浆5 mL放入15 mL离心管中，并添加蒸馏水至15 mL，以4 600 r·min-1离心20 min，上清液即为内生真菌诱导子，于121 ℃灭菌20 min后添加至已处于生长旺盛期的火木层孔菌液体培养液中，以相同的条件继续培养1周。

2.4高效液相色谱分析

2.4.1样品处理 将上述添加了真菌诱导子共培养的火木层孔菌培养液用等体积乙酸乙酯萃取3次，合并后浓缩。取10 mg样品溶解于1 mL甲醇，过滤后备用。

2.4.2色谱条件 色谱柱：Agilent XDB-C18(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)；流动相：甲醇(A)-2 mL·L-1甲酸水溶液(B)，梯度洗脱(见表1)；流速：1.0 mL·min-1；柱温：35 ℃；检测波长：380 nm；进样量：10 μL。

2.5液质联用测定

2.5.1液质联用高效液相条件 流动相为甲醇(A)-2 mL·L-1甲酸水溶液(B)；流速：0.25 mL·min-1；进样量：3 μL；柱温：40℃；检测波长：380 nm。高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)洗脱条件见表1。

表1 乙酸乙酯层提取物流动相洗脱梯度Tab.1 Liquid phase elution gradient of ethyl acetate layer extract

2.5.2质谱条件 离子源：电喷雾双喷离子源(dual AJS ESI)正、负离子模式；毛细管电压：3 500 V；干燥气温度：350 ℃；流速：12 L·min-1；雾化气电压：40 Psi；扫描范围m/z(100～1 000)。

3 结果

3.1桑黄中内生真菌的分离结果 应用反复划线法，共分离得到12株内生真菌，菌落照片见图1。在PDA培养基上28 ℃培养7 d后，于扫描电镜低倍镜(× 1 500)下观察内生真菌菌丝体的细节，见图2。由图2可见，除SHM-1、SHTD-2和HHTD-3的菌丝体较为发达外，其余真菌产孢子量非常丰富，孢子大部分为球形，也有梭形和杆形。

图1 野生桑黄子实体中内生真菌菌落的照片Fig.1 Photographs of endophytic fungi colonies in wild body of P.igniarius

图2 内生真菌在扫描电镜下的照片 (×1 500)Fig.2 Image of endophytic fungi under scanning electron microscope (×1 500)

3.2火木层孔菌的生长曲线 见图3。由图3可见，在培养火木层孔菌14～16 d时，其进入生长旺盛期，菌丝体干质量的最大值约为0.5 g，因此选择该培养时间节点(15 d)加入生物诱导子，考察生物诱导子对火木层孔菌次生代谢的影响。

图3 火木层孔菌的生长曲线Fig.3 Growth curve of P.igniarius

3.3生物诱导子对火木层孔菌次生代谢的影响 通过HPLC-二极管阵列检测器(diode array detector，DAD)检测发现，在380 nm(桑黄素类成分的最大吸收波长)处，火木层孔菌的次级代谢有3个主峰(见图4)。经诱导子SHTD-4、HHTD-3、HHTD-2和SHM-2调控后的火木层孔菌的次级代谢变化较大(见图5)，其中SHTD-4、HHTD-2和HHTD-3都使火木层孔菌次级代谢峰1的量增加而峰2和峰3的量有所下降，而用SHM-2诱导后，原峰1～3的含量均下降，在12 min之后出现一个新峰，通过与对照品做对照(见图6)和应用电喷雾质谱(ESI-MS)负离子模式进行化合物结构分析(见图7)，确定该峰为phelligridin G([M-H]-593.1779，分子式为C32H20O12，相对分子质量为594.474 3。

图4 火木层孔菌次级代谢产物的HPLC图注：1、2、3峰为火木层孔菌次级代谢产物。Fig.4 HPLC chromatograms of secondary metabolites of P.igniariusNotes:1,2,3 peaks were secondary metabolites of P.inniarius.

图5 生物诱导子诱导火木层孔菌次级代谢产物的HPLC图注：A.SHTD-4；B.HHTD-3；C.HHTD-2；D.SHM-2;1、2、3峰为火木层孔菌次级代谢产物。Fig.5 HPLC chromatograms of secondary metabolites of P.igniarius induced by biological elicitorNotes:A.SHTD-4；B.HHTD-3；C.HHTD-2；D.SHM-2;1,2,3 peaks were secondary metabolites of P.igniarius.

图6 phelligridin G对照品的HPLC图Fig.6 HPLC chromatogram of reference substance of phelligridin G

图7 SHM-2诱导火木层孔菌后的质谱图和结构注：A.液质色谱图；B.二级质谱图(负离子模式)。Fig.7 Mass spectrum and structure of P.igniarius induced by SHM-2Notes：A.chromatogram of HPLC-MS；B.secondary mass spectrum (negative ion mode).

4 讨论

桑黄是具有抗肿瘤、提高免疫力等生物活性的药食两用真菌，随着人们对保健的重视，药食同源大型真菌的使用率也逐年上升。然而，桑黄的野生资源非常稀少，且栽培时间较长[13]，若想使其具有药用价值一般需要栽培3年以上。因此，如何获得与桑黄相似功能的药用资源是当下科研工作需要解决的重要问题。火木层孔菌是桑黄的基原菌种之一，其次级代谢产物包括多糖、倍半萜、三萜及hispidin等成分，与桑黄子实体的成分相似[6，14]，但在桑黄子实体中含量较高的hispidin衍生物在火木层孔菌中却未发现，hispidin衍生物是桑黄具有抗氧化、抗癌及降血糖等活性的药效物质基础[2-5]。因此，如何改变火木层孔菌的次级代谢产物的代谢途径、诱导火木层孔菌产生hispidin衍生物，从而能使其从药用价值上代替桑黄子实体值得深入研究。查阅文献发现，利用真菌诱导子和纳米粒子等处理植物培养细胞以促使细胞快速、大量合成目的次生代谢产物的方法已被人们普遍重视[15-16]。真菌诱导子在植物细胞培养中应用较多，能显著提高植物生物碱、红厚壳素、白藜芦醇、银杏内酯B[17-19]等多种次生代谢产物的产量。本研究诱导火木层孔菌产生的phelligridin G是野生桑黄子实体中含有苯并吡喃酮结构的高度氧化的成分，对卵巢癌细胞(A2708)和人结直肠癌细胞(HCT-8)有选择性细胞毒活性，对小鼠肝微粒体的脂质过氧化物酶有抑制活性[20]。本研究通过生物诱导法使火木层孔菌产生原本不能产生的hispidin衍生物phelligridin G，虽然产量低，但可为后续诱导机制的研究奠定关键的物质基础，在此基础上若能明确产生phelligridin G的关键催化酶，则可使大量生产该化合物成为可能。由此可见，在桑黄野生资源短缺、人工栽培难度大且具有药用价值的桑黄生长年限长的情况下，生物诱导可为实现桑黄的资源开发和利用奠定物质基础。