焦磷酸测序技术在猪繁殖与呼吸综合征诊断检测中的应用

曹丙蕾，张 群，刘 敏，王 群，尹伟力

（1.济南海关技术中心，山东 济南 250014；2.青岛海关技术中心，山东 青岛 264001）

猪繁殖与呼吸综合征又称蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的一种急性高度传染性疾病，主要表现为母猪繁殖障碍和仔猪呼吸障碍[1-3]。研究发现，猪高热病主要是由高致病性PRRSV 引起的，及时准确检测PRRSV 是猪蓝耳病诊断和防控的重要前提[2-4]。

焦磷酸测序技术是一种短链测序技术。该技术可以简便即时高效地进行短DNA 序列分析，检测通量高，可同时对多达96 个样本进行测序，无需对DNA 片段进行电泳和荧光标记，有效保证了检测结果的准确可靠[5]。本研究针对PRRSV 的N 蛋白基因序列，建立了一种可直接确定基因序列的焦磷酸测序技术。通过测序结果，直接在基因序列水平对PRRSV 进行鉴别诊断，避免存在假阳性结果，提高了阳性检出率，在基因水平上准确鉴定PRRSV。

1 材料与方法

1.1 材料

PRRSV、猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）等病毒样本由本实验室保存。M-MLV 反转录酶、PrimeScript One Step RT-PCR Kit、100bp DNA Ladder Marker 及相关试剂等购自Takara 公司；PyroMarkTM ID System、Vacuum Prep Tool、链霉亲和素包被磁珠、PyroGold SQA Reagents 1×96 DNA 序列分析试剂盒及相关试剂均为Gene 公司产品。核酸提取仪及配套的核酸提取试剂盒由天根科技提供。

1.2 方法

1.2.1 焦磷酸测序引物的设计

从GenBank 上筛选出PRRSV N 蛋白基因（ORF7 基因）的保守序列，利用焦磷酸测序分析软件设计一对扩增引物N-F和N-R 及测序引物N-S，见表1，引物N-R 5’端加入生物素标记，预期片段大小为239bp。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

表1 PRRSV的扩增引物及测序引物Tab.1 The amplification primers and sequencing primers of PRRSV

1.2.2 病毒核酸的提取

收集PRRSV、PEDV、TGEV 等病毒材料采用磁珠法核酸提取原理进行核酸提取，使用专用核酸提取试剂盒，按照说明书进行操作，提取的核酸立即使用或-70℃保存备用。

1.2.3 RT-PCR反应

按照一步法RT-PCR 试剂盒说明配置50 μL 反应体系，反应条件如下：50℃30 min；94℃2 min；94℃30 s，56℃30 s，72℃30 s，35 个循环；72℃7 min，反应结束后取5 μL PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，一部分产物送往上海生工生物工程有限公司进行测序，其余扩增产物进入下一步焦磷酸测序。

1.2.4 焦磷酸测序反应

制备测序单链模板。依据仪器操作说明制备测序单链模板，将含有链霉亲和素包被磁珠的结合缓冲液与PCR 产物振荡混匀10min，用超纯水冲洗vacuum prep tool 30 s，抓取结合PCR 产物的磁珠，再接着用70%乙醇洗涤5 s，Denatureation buffer 洗涤5 s，Washing buffer 中清洗10 s，将vacuum prep tool放入含有测序引物的PSQ 96孔板中，摇晃释放磁珠，将反应板置于基因扩增仪上80℃恒温2 min，自然冷却。

测序反应。根据仪器设定的程序和试剂用量，将酶混合物（DNA 聚合酶、ATP 硫酸酯酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶）、底物APS 和dNTP 加入试剂舱对应孔位，将试剂舱和96 孔测序板移入仪器反应舱中，运行仪器程序，反应结束后系统出具测序结果，通过在线BLAST分析即可得知结果并比较其序列特异性。

1.2.5 特异性试验

以PRRSV、TGEV、PEDV 和PRV 等核酸为模板进行RTPCR 扩增，按照上述1.2.4 进行焦磷酸测序检测，结果直接显示基因序列，通过BLAST分析确定反应特异性。并对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，鉴定引物的特异性。

1.2.6 灵敏度试验

对PRRSV 核酸（60ng/μL）依次进行梯度稀释后，各个稀释度分别作为模板进行扩增，通过琼脂糖凝胶电泳检测扩增条带，并确定用于焦磷酸测序中RT-PCR 的最低检测限，同时也对各个稀释度的扩增产物进行焦磷酸测序。

1.2.7 重复性试验

对同一份扩增产物进行3 次焦磷酸测序，对结果进行分析，同时，对同份核酸进行3 次扩增并进行焦磷酸测序，对结果进行分析，确定方法的重复性和稳定性。

1.2.8 在实际检测中的应用

从20 个疑似PRRSV 的临床样本中提取核酸，经扩增后进行焦磷酸测序。同时将扩增产物送往上海生工生物工程有限公司进行测序。通过两者结果比对，确定该焦磷酸测序技术的高效性和实用性。

2 结果

2.1 RT-PCR结果

PRRSV 核酸扩增片段大小为239 bp，与预期目的片段大小一致。测序结果表明目的条带与PRRSV N 蛋白基因片段具有100%的同源性。

2.2 焦磷酸测序技术

焦磷酸测序仪出具的PRRSV 短序列为：CTAGCGACTGAAGATGATGTCAGAC ATCACTTTACCCC，焦磷酸测序结果与普通测序结果相比，符合率为100%，无序列差异，且该序列进行BLAST分析后发现，该序列结果属于PRRSV N蛋白基因的特异性序列，以此为准可直接进行PRRSV 的确诊，避免了假阳性结果的出现，且在35 min左右即可完成焦磷酸测序，与外送测序相比，大大提高了工作效率。

2.3 特异性试验

特异性试验结果表明，只有PRRSV获得了焦磷酸测序的序列结果，通过BLAST 分析，该结果与目的片段符合率为100%，其他无关核酸样品无序列结果显示，扩增产物经电泳分析，只有PRRSV扩增出了目的片段，其余未见有条带出现，所建立的焦磷酸测序技术具有较好的特异性。

2.4 灵敏度试验

从RT-PCR 的结果分析来看，RT-PCR 扩增的最低核酸检测限为0.1pg/test，由于要达到焦磷酸测序所要求的条件，故在焦磷酸测序中最低核酸检测限为10 pg/test。

2.5 重复性结果

经多次重复性检测，检测结果均保持一致，所建立的焦磷酸测序技术具有较好的重复性和稳定性。

2.6 样品检测

经临床样本检测，阳性15 例，阴性5 例，测序结果与焦磷酸盐测序结果和普通测序结果一致，符合率为100%，且与普通测序相比，明显提高了检测效率和准确性。

3 讨论

实验室常用的动物疫病病原诊断方法有很多，包括病毒分离鉴定、RT-PCR 和荧光RT-PCR 等，这些都有一定的特异性和敏感性，在动物疫病的筛查诊断中发挥了很大的作用，但是无法立马得知分子诊断的基因序列，会导致假阳性结果的出现，无法获知准确结果，即便进行目的片段测序，也需要再采用Sanger 测序法进行，这无疑将检测时限延长了，无法立即判定准确结果，耗时耗力。

焦磷酸测序是一种全新的短序列测序检测技术，可通过短序列片段的基因序列即时判定结果，具有直观、快速、灵敏等特点，且省去了Sanger 测序或外送测序公司测序确诊的步骤，基因序列结果可直观地通过焦磷酸测序展现出来，减少假阳性结果的出现，提高了动物疫病诊断效率，且焦磷酸测序检测时限短，缩短了检测时长，提高了确诊工作效率，为动物疫病防控提供了高效的检测手段。

目前，猪蓝耳病仍是引起猪群重大动物流行病的主要疾病之一，有欧洲型和美洲型2 种基因型。PRRSV 有多个结构蛋白，其中以编码核衣壳蛋白（N）的ORF 7基因最为保守，该蛋白是免疫原性最强的蛋白，能刺激机体产生强烈的免疫应答，因此，蛋白基因也是各个学者及研究机构研究PRRSV 的首选研究对象[2，4]。

本研究选用PRRSV N蛋白基因为研究对象，设计了焦磷酸测序技术的扩增引物及测序引物，经扩增后将产物直接进行焦磷酸测序，获得一段特异性的基因序列，该短序列可作为PRRSV 鉴定的靶序列，直接从基因序列中确定PRRSV。鉴于焦磷酸测序可以直接获取序列结果，下一步研究方向主要是利用这一技术特点来研究PRRSV的变异情况，直接从基因序列的突变、缺失、插入等情况来判定目前猪繁殖与呼吸综合征的流行趋势，便于更好地进行疫病监控与追踪。