气相色谱-质谱联用法测定荷叶表面蜡质成分

罗 倩，瞿国润，吕霁烊，孙 伟，张 薇，祝新德，石建新

(上海交通大学生命科学与技术学院，上海 200240)

原生种荷花(Nelumbonucifera)在中国有着悠久的栽培历史。荷花是莲科(Nelumbonaceae)莲属(Nelumbo)多年生水生宿根草本植物，不仅有独特的观赏功能，还具有药用和食用价值。

荷叶正面拥有阻水功能和表面自清洁功能，称为荷叶效应[1-2]。该功能源于荷叶表面的特殊结构、蜡质成分及其分布。荷叶的气孔位于叶片的正面，其周边表面是由微米到纳米级的乳突状小丘铺成，上面覆盖有管状的蜡质成分。这些管状结构是直链二醇(diols)和直链次级醇(secondary alcohol)因其结构特点发生弯折围拢而成的[2-4]。该密集结构造就了荷叶独特的阻水功能，形成了荷叶效应。

蜡质是覆盖在植物表面最外层的一层脂类保护物质，主要由长链脂肪酸、烷烃、醛、酮、长链脂肪醇(伯醇)、次级醇、长链双醇等成分组成。植物叶片表面蜡质的组成及含量因植物种类而异，而不同的蜡质组合构成了植物叶片丰富多样的表面形态和性质，荷叶效应就是其中的典型代表。一直以来，荷叶效应的研究是材料、纺织、防腐甚至军事等领域的关注点。有研究者提取荷叶表面蜡质成分进行自组装，开发新型疏水材料[5]；还有学者模仿荷叶表面张力特性进行仿生材料研究[6-7]。因此，更好地了解荷叶蜡质化学成分组成能够为这些研究提供理论依据和基础数据。国外对荷叶效应的早期研究涉及到荷叶表面的细胞结构及覆盖其上的蜡质类型和分布[3-4]。这些研究对荷叶表面蜡质化学成分进行了描述，但是均未对其检测方法，尤其是鉴定方法进行说明，且对同系物和同分异构体的分析不够深入。

本实验拟采用气相色谱-质谱法检测荷叶表面蜡质成分，结合成分鉴定手段对蜡质成分中的同系物和同分异构体及其相对百分含量进行测定和比较，以期为荷叶生长发育相关机理研究和荷叶效应的应用研究提供方法支持。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

TSQ8000气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)，GC-OrbitrapTM高分辨气相色谱-质谱联用仪(GC-HRMS)：美国Thermo Fisher公司产品。

正构烷烃标准品混合液(C7～C40)，内标物正二十四烷烃(C24ALK)，衍生化试剂BSTFA(bis-N,N-(trimethylsilyl) trifluoroacetamide)，吡啶(Pyridine)：美国Sigma公司产品；氯仿(色谱纯)：美国Tedia公司产品。

实验使用的器皿和移液器等均为玻璃制品，使用前需用氯仿冲洗。

1.2 标准品制备

准确称取一定量的C24ALK标准品于容量瓶中，用氯仿溶解并配制成浓度为0.2 g/L的标准品母液，密封后置于4 ℃冰箱保存。

1.3 实际样品处理

新鲜成熟荷叶采摘自上海交通大学捭阖塘中，每次摘取3片荷叶。剪取每片荷叶的中间部分(2 cm×2 cm)，每个叶片取5个样品，分别置于5个玻璃瓶内用于分析。加入2 mL氯仿、50 μL内标，提取1 min，再重复提取1次，收集2次的提取液至玻璃反应瓶中，使用氮吹仪将其吹干至100 μL，加入20 μL吡啶、20 μL BSTFA，密封后于70 ℃衍生40 min。反应结束后，将降至常温的反应液转移至GC样品瓶，准备上样。

1.4 仪器条件

仪器的实验条件参考文献[8]，具体条件为：DB-5ms毛细管气相色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；脉冲不分流进样，压力275.8 kPa，保持0.7 min；Agilent分流衬管；进样体积1 μL；进样口温度300 ℃；炉温箱起始温度50 ℃，保持1 min，以40 ℃/min升温至200 ℃，保持1 min，以3 ℃/min升温至300 ℃，保持15 min；传输线温度300 ℃；离子源温度300 ℃；EI电离能70 eV；全扫描模式，质量扫描范围m/z50～650。

1.5 高分辨气相色谱-质谱参数

采用与1.4节相同的气相色谱采集条件和离子源条件，分辨率60 000 FWHM；质量扫描范围m/z50～650。

2 结果与讨论

2.1 蜡质成分的鉴定

荷叶蜡质成分的总离子流图示于图1。其主要成分是直链伯醇(primary alcohol, 1-ol)、直链次级醇(secondary alcohol, sec-ol)和直链二醇(alkanediol, diol)，此外，还有直链脂肪酸(fatty acid, FA)、直链烷烃(alkane, ALK)等，详情列于表1。该检测结果与文献[3-4]报道的荷叶蜡质组分基本一致。

蜡质成分的鉴定包括可能的结构组成、碳链长度和羟基功能团位置等。基于GC-MS联用检测到的离子峰和特征离子碎片，以及二醇和次级醇的质谱碎裂规律，结合相关文献[9-11]，鉴定得到GC-HRMS对碎片精确质量数的验证(结构精确质量偏差在1 ppm以内)，结果示于图2。

2.1.1直链伯醇同系物系列 硅烷化后的长碳链伯醇同系物共同的特征是含有m/z57、71、73、85、103和M-15系列碎片(M是指硅烷化后的产物分子质量，15为失去CH3)。其中m/z73是硅烷化特征碎片，m/z103碎片丰度较显著，示于图2a。

图1 荷叶表面蜡质成分的总离子流色谱图Fig.1 Total ion chromatogram of wax components on lotus leaf surface

表1 荷叶表面蜡质伯/次级醇类和二醇成分及其特征碎片Table 1 Related fragments of primary/secondary alcohol and alkane diol detected on lotus leaf surface

续表1

注：a.伯醇硅烷化产物；b.次级醇硅烷化产物；c.二醇硅烷化产物；特征碎片标注精确质量偏差图2 荷叶蜡质成分的质谱图及其特征碎片示意图Fig.2 Mass spectra and fragmentation diagram of wax components of lotus leaf

2.1.2直链次级醇同系物及同分异构体 硅烷化后的长碳链次级醇同系物产物共同的特征是含有m/z57、71、73、85和M-15系列碎片，羟基在EI源轰击碎裂会得到2个特征碎片。例如，C29-10-OL(nonacosan-10-ol)是荷叶典型的次级醇，含有一对m/z229([C10H20OTMSi]+)和m/z369 ([C20H40OTMSi]+)特征离子，以及m/z481(M-15)。根据这对特征碎片以及M-15特征离子可以鉴定不同碳链长度及羟基位点的次级醇(图2b)，以及碳链长度相同但羟基位点不同的同分异构体(表1)。

2.1.3直链二醇(diol)同系物及同分异构体 硅烷化后的长碳链二醇同系物产物均含有m/z57、71、85系列特征离子，m/z73、147特征硅烷基化碎片及M-15和M-90(M-TMSiOH)特征碎片。不同位点的羟基会在EI源轰击后形成多个系列的特征碎片。例如C29-4,10-diol(nonacosane-4,10-diol)形成含有1个硅烷基团的m/z145 ([C4H8OTMSi]+)、m/z369 ([C20H40OTMSi]+)，以及含有2个硅烷基团的m/z317([C10H19(OTMSi)2]+)、m/z541([C26H51(OTMSi)2]+)，这2个硅烷基团也会丢失TMSiOH，形成m/z227、451特征碎片。此外，还可观察到m/z569(M-15)和m/z494(M-90)碎片(图2c)。

这些直链二醇同系物因为2个羟基位点不同，构成的同分异构体可根据质谱特征碎片进行鉴定，结果列于表1。

2.1.4直链脂肪酸和直链烷烃 直链脂肪酸和直链烷烃通过NIST谱库进行鉴定。

2.1.5保留指数 将C7～C40正构烷烃标准品混合液按照1.4节条件上样，获得烷烃保留时间[12]，然后根据线性保留指数计算公式，计算出荷叶各个组分的保留指数(RI)。

RI=100Z+100[tR(x)-tR(Z)]/

[tR(Z+1)-tR(Z)]

(1)

式中，tR为保留时间(min)；x为待分析的化合物；Z，Z+1为两个相邻正构烷烃的碳原子数，且tR(Z)

2.2 蜡质成分的定量分析

2.2.1各组分的含量及占比 以C24ALK为内标，计算每个成分的相对百分含量和同系物系列化合物的比例。根据GC-MS提取的特征离子响应比例，计算同系物内各个同分异构体的比例。

2.2.2荷叶中长碳链次级醇成分 鉴定出的长碳链次级醇的碳链长度在29～37之间，都是奇数次级醇。这组同系物以C29ol为主，相对百分含量约占86.6%，其他各成分含量列于表2，这些次级醇的羟基位点基本以第10位为主。值得一提的是，C31、C33和C35这3种次级醇均为不同羟基位点的混合物，利用GC-MS法提取特征离子进行比较分析，发现C33的次级醇应该是羟基分别在11、10和9位(按流出顺序)的混合物，以C33-10-ol为主，三者百分比分别约为(11.1±1.5)%、(67.3±7.0)%和(21.6±6.0)%；碳链长度为35的次级醇应该是羟基分别在11、10和9位(按流出顺序)的混合物，以C35-10-ol为主，三者百分比分别约为(14.6±2.3)%、(66.8±4.8)%和(18.6±5.2)%；比较特殊的是碳链长度为31的次级醇，其羟基位点分别在第12、11和10位(按流出顺序)的混合物，以C31-12-ol为主，三者百分比分别约为(73.5±4.1)%、(23.9±4.0)%和(2.6±0.4)%，该结果与文献[3]报道一致。此外，还发现了偶数碳链的次级醇，包括C28～C38的次级醇，与奇数次级醇相比，它们的含量很低。

表2 荷叶表面蜡质中次级醇和二醇的同系物及其同分异构体的相对百分含量Table 2 Relative composition of the homologue and isomer of secondary alcohols, alkane diols in the total wax of lotus leaf

2.2.3荷叶中长碳链二醇成分 已有文献[1-2,9]报道，植物中的二醇来源于其对应碳链的次级醇。本实验发现，荷叶中长碳链二醇成分以C29二醇为主，经分析，C29 diol由6种系列二醇同分异构体组成。按2个羟基位置区分，以C29-4,10-diol和C29-5,10-diol含量居多，百分比分别为(47.1±6.3)%和(37.5±4.6)%；C31、C33和C35二醇产物比较复杂，通过气相色谱-质谱检测发现三者含量低，存在共流出情况，因此难以单独鉴定，以MIX代替。二醇产物的复杂性可能来自于其上游底物次级醇本身的混合性。

2.2.4荷叶表面蜡质成分的组成分析 各组分计算结果按类别分别合计后，得到每个类别组分在总组分中的占比，结果示于图3。荷叶蜡质成分中，以二醇含量最高，约占总蜡质的71%；其次是次级醇，约占20%；再次是烷烃，约占7%；脂肪酸及伯醇类蜡质成分很低，小于1%。

3 结论

荷叶表面细胞的超微结构和分布的蜡质与荷叶效应直接相关。荷叶中含有多种化学组分，不同的化学成分需要使用不同的检测方法。超高效液相色谱-串联四极杆静电场轨道阱质谱联用技术和UPLC-Q TOF-MS/MS 技术可用于荷叶中荷叶碱和黄酮类等物质的鉴定[13-14]。荷叶表面的蜡质成分主要由非极性的脂类小分子化合物组成，因此，气相色谱-质谱是比较理想的检测方法。

图3 荷叶表面各类蜡质成分的相对百分含量Fig.3 Relative contents of various wax compositions detected in lotus leaf surface

本课题组对植物表面蜡质成分测定中的气相色谱-质谱条件进行了优化，并建立了植物组织蜡质的定性和定量方法[8]。本实验使用更新的TSQ8000 GC-MS联用仪，不仅成功地鉴定出荷叶蜡质中的全部蜡质成分，还利用质谱仪产生的有效离子碎片，对直链次级醇和直链二醇的不同碳链的同系物和相同碳链的同分异构体进行分析。在此基础上，利用高分辨质谱对特征碎片的准确性进行验证。

本方法对于进一步了解荷叶蜡质成分对荷叶乃至整个荷花植株的生长发育，以及对水淹、UV照射等自然逆境反应都具有极其重要的意义，对于深入了解荷叶效应背后的分子遗传机制及可能的应用具有重要价值。