APP下载

基于UPLC-Q/TOF MS及网络药理学的丹参川芎嗪注射液抗血瘀活性成分和机制研究

2021-02-27董庆海刘俊丽林红强焦玉凤刘云鹤王钟瑶刘金平李平亚

质谱学报 2021年1期
关键词:川芎嗪丹参靶点

董庆海,刘 慧,刘俊丽,林红强,焦玉凤,司 雨,刘云鹤,王钟瑶,刘金平,李平亚,李 卓

(1.吉林大学药学院天然药物研究中心,吉林 长春 130021;2.吉林四长制药有限公司,吉林 梅河口 135000)

丹参川芎嗪注射液具有抗血小板聚集、清除氧自由基、改善微循环、改善脑循环的作用[1],临床上用于治疗闭塞性脑血管疾病及缺血性心血管疾病[2]。药物的化学成分是其发挥药理作用的物质基础。目前,关于丹参川芎嗪注射液化学成分的报道多集中于丹参酚酸的检测及含量测定[3],尚未见丹参川芎嗪注射液中化学成分的分析。因此,有必要进一步研究丹参川芎嗪注射液的化学成分,进而明确其药效物质基础,建立科学的质量控制方法。

超高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱技术(UPLC-Q/TOF MS)以超高效液相色谱作为色谱分离系统,将四极杆和飞行时间质谱作为分析器[4],可精确测定分子质量,且灵敏度高、选择性好、分离准确、速度快。

通过前期的药效学研究[5]发现,丹参川芎嗪注射液能够明显改善急性血瘀模型大鼠血液流变学指标,并通过下调血浆中GMP-140蛋白、vWF因子含量治疗血瘀。但是,尚不明确注射液中哪些成分发挥了治疗作用。2008年,Hopkins[6]提出网络药理学的概念,并将其定义为运用网络方法分析药物、作用靶点和疾病之间“多成分-多靶点-多途径”作用关系的药理分支学科[7]。网络药理学认为,机体的健康是由复杂的动态生物网络来维持的,动态网络的失衡导致疾病的发生,即网络中某些靶点处于功能失衡状态[8]。在运用网络药理学研究某种药物治疗某种疾病的作用机制时,以生物网络中的靶点为切入点,从整体网络动态稳定角度分析药物中分子与网络中功能失衡靶点的关联及动态变化规律[9]。构建化学成分-靶点-信号通路-疾病全方位多层次网络模型,可深刻揭示药物分子和动态生物网络的关系,系统解释药物分子发挥作用的机制[10]。

本实验拟采用网络药理学研究方法并结合UPLC-Q/TOF MS技术,通过保留时间、准分子离子质荷比及碎片离子,分析鉴定丹参川芎嗪注射液的化学成分,并据此研究该注射液治疗血瘀的活性成分和作用机制。

1 实验部分

1.1 药品与试剂

丹参川芎嗪注射液(批号:20170211):吉林四长制药有限公司产品;甲醇:分析纯,天津新通精细化工有限公司产品;甲酸钠、乙腈:美国Fisher公司产品;亮氨酸-脑啡肽:美国Sigma公司产品;实验用水:屈臣氏纯净水,广州屈臣氏食品饮料有限公司产品。

咖啡酸(批号:110885-201102)、迷迭香酸(批号:111871-201102)、盐酸川芎嗪(批号:110817-201006)对照品:由中国食品药品检定研究院提供;原儿茶醛(批号:110810-200205)、丹参素钠(批号:110855-200809)、丹参素钠(批号:110855-200809)对照品:由中国药品生物制品检定所提供;丹酚酸B(批号:150927)、原儿茶酸(批号:171109)、丹酚酸A(批号:171217):北京普天同创生物科技有限公司产品。

1.2 仪器与装置

FA1104N型电子天平:上海民桥精密科学仪器有限公司产品;TGL-16aR型飞鸽超离速离心机:上海安亭科学仪器厂产品;RE52CS型旋转蒸发器:上海亚荣生化仪器有限公司产品;N-A35型氮气发生器:青岛海科仪器有限公司产品;Xevo G2-XS型Q-TOF质谱仪、ACQUITY UPLC型二元泵和样品管理器、UNIFI科学信息学系统:美国 Waters公司产品。

1.3 实验条件

1.3.1色谱条件 ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(100 mm×2.1 mm×1.7 μm);柱温30 ℃;样品管理器温度15 ℃;进样体积5 μL;流速0.4 mL/min;流动相:A为0.1%甲酸-水溶液,B为0.1 %甲酸-乙腈溶液;梯度洗脱条件:0~2 min(10%B),2~26 min(10%~90%B),26~28 min(90%B),28~29 min(90%~10%B),29~30 min(10%B)。

1.3.2质谱条件 电喷雾离子源(ESI),MSEcontinuum模式;质量扫描范围m/z100~1 500;正、负离子检测模式;正、负离子模式下,毛细管电压分别为2.6 kV和2.2 kV,锥孔电压均为40 V,锥孔气流量50 L/h,脱溶剂氮气流量600 L/h,氩气流量0.15 mL/min,离子源温度120 ℃,脱溶剂气温度300 ℃;低能通道碰撞能量6 V,高能通道碰撞能量20~40 V;采用100 ng/L亮氨酸-脑啡肽([M+H]+(m/z556.277 1)、[M-H]-(m/z554.262 0))作为Lock Spray校正标准液,对仪器进行实时校正,其校正流速为正离子模式15 μL/min,使用甲酸钠溶液对质量数进行校正。

1.4 丹参川芎嗪注射液样本的处理

取1支丹参川芎嗪注射液(5 mL/支),于80 ℃下减压旋干,并用80%甲醇复溶,置于2 mL容量瓶,用80%甲醇稀释并定容。混合均匀后,于4 ℃下以10 000 r/min离心10 min,吸取适量溶液于进样瓶中,备用。

1.5 数据处理

采用UPLC-Q/TOF MS模式采集数据,使用UNIFI软件进行丹参提取液化学成分的自动识别。第一步,查阅文献,建立丹参、川芎嗪数据库以补充原有的传统中药库,将查找到的化合物化学结构保存为mol格式文件,然后将丹参、川芎嗪数据库导入分析方法中;第二步,将原始数据通过Waters Compression and Archival Tool v1.10软件进行压缩;第三步,UNIFI软件自动对数据筛查、鉴定,代替传统的人工提峰、计算分子式以及分析碎片断裂情况;第四步,建立一个过滤筛选方法,设定质量误差为±6×10-6,且响应值大于3 000;最后,结合碎片离子理论精确质量数、保留时间和分子式,使用对照品比对以及查阅相关文献,对各主要化合物进行人工识别和鉴定。

1.6 活性成分、疾病靶点、作用通路网络图的构建

对鉴定出的化合物进行筛选,将符合里宾斯基五规则的化合物归类为活性成分。将活性成分输入到TCMSP(http:∥lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)、BATMAN-TCM(http:∥bionet.ncpsb.org/batman-tcm)、Swiss Target Prediction(http:∥www.swiss target prediction.ch)等数据库中收集活性成分的靶点,构建活性成分潜在作用靶点库。以血瘀相关疾病为关键词(如血栓、静脉血栓、动脉血栓、脑血栓、冠状动脉血栓),在TTD(http:∥bidd.nus.edu.sg/group/cjttd)、DisGeNET(http:∥www.disgenet.org)、GeneCards(https:∥www.genecards.org)等数据库中搜索已报道的疾病靶点,构建疾病靶标库。将活性成分潜在作用靶点库与血瘀疾病相关靶标库进行对比分析,筛选出其中的交集靶。将活性成分和与之相应的交集靶点导入Cytoscape软件,构建活性成分-抗血瘀靶点网络。将交集靶点输入DAVID(https:∥david.ncifcrf.gov)数据库中,进行KEGG通路富集分析,根据得到的结果构建疾病靶点-作用通路网络图。

2 结果与讨论

2.1 丹参川芎嗪注射液化学成分

正、负离子模式下的质谱基峰离子流图示于图1。利用UNIFI数据处理系统和MassLynx 4.1软件对丹参川芎嗪注射液进行定性分析。根据得到的精确分子质量,获得可能的元素组成,确定可能的分子式。通过对各成分进行二级质谱分析,得到特征碎片离子,再结合对照品及相关文献,共鉴定出40个化学成分,包括黄酮类、酯类、醌类、醇类、苯酚类、萜类、茋类、酚酸类、有机酸类、糖类和吡嗪类化合物,其保留时间、分子式、准分子离子峰实测值及理论值、质量误差、主要碎片离子和来源等信息结果列于附表1,并对其结构进行归属,结果示于附图1~5(因篇幅所限,附表、附图请登录“质谱学报”网站下载http:∥www.jcmss.com.cn)。

2.1.1黄酮类化合物的鉴定 从注射液中鉴定出4种黄酮类化合物。以化合物1为例,在ESI-模式下,保留时间为0.64 min,准分子离子峰为m/z377.084 6[M+HCOO]-,产生2个主要碎片离子,碎片m/z282.019 2为母离子失去2个-CH3、1个H2O得到的[M-H-2CH3-H2O]-,碎片m/z197.042 1为母离子失去1个C8H6O2得到的[M-H-C8H6O2]-,其高能质谱图和裂解碎片示于图2。结合文献报道[11],推断化合物1为1-羟基-2,3,4,7-四甲氧基吨酮。

2.1.2酯类化合物的鉴定 从注射液中鉴定出12种酯类化合物。以化合物13为例,在ESI-模式下,保留时间为5.40 min,准分子离子峰为m/z537.103 4[M-H]-,产生3个主要碎片离子,碎片m/z493.113 6为母离子失去1个HCOOH得到[M-H-HCOOH]-,碎片m/z295.059 9为母离子失去1个HCOOH、1个C9H9O5得到[M-H-HCOOH-C9H9O5]-,碎片m/z185.022 3为母离子失去1个HCOOH、1个C9H9O5、1个C6H5O2得到[M-H-HCOOH-C9H9O5-C6H5O2]-,其高能质谱图和裂解碎片示于图3。结合文献报道[12],推断化合物13为紫草酸。

2.1.3醌类化合物的鉴定 从注射液中鉴定出7种酯类化合物。以化合物28为例,在ESI-模式下,保留时间为10.60 min,准分子离子峰为m/z331.190 2[M+HCOO]-,产生2个主要碎片离子,碎片m/z255.172 9为母离子失去1个H2O、1个CH3得到[M-H-H2O-CH3]-,碎片m/z203.105 2为母离子失去1个C6H12得到[M-H-C6H12]-,其高能质谱图和裂解碎片示于图4。结合文献报道[13],推断化合物28为柳杉酚。

图1 丹参川芎嗪注射液在正(a)、负离子模式(b)下的基峰离子流(BPI)图Fig.1 Base peak intensity (BPI) chromatograms of Danshen Ligustrazine injection at positive (a) and negative (b) modes

2.1.4有机酸及醇类化合物的鉴定 从注射液中鉴定出12种有机酸及醇类化合物。以化合物2为例,在ESI-模式下,保留时间为0.99 min,准分子离子峰为m/z197.043 2[M-H]-,产生3个主要碎片离子,碎片m/z179.032 6为母离子失去1个H2O得到的[M-H-H2O]-,碎片m/z135.042 5为母离子失去1个H2O、1个HCOOH得到的[M-H-H2O-HCOOH]-,碎片m/z123.034 0为母离子失去C2H3O3得到的[M-H-C2H3O3]-,其高能质谱图和裂解碎片示于图5。这与丹参素对照品的保留时间和碎片离子相吻合,推断化合物2为丹参素。

2.2 活性成分库的构建

里宾斯基五规则常被用于对化合物进行初筛,去除不适合成为药物的分子。通过TCMSP数据库,从40个化学成分中筛选出20个符合里宾斯基五规则的化合物,并将其归类为活性成分,结果列于表1。

2.3 活性成分靶点库、血瘀疾病靶点库的构建

收集20种活性成分在TCMSP、BATMAN-TCM、Swiss Target Prediction数据库中作用的靶点,利用UniProt数据库将活性成分对应的靶点名转换为人源(homo sapiens)的标准基因。将整理好的靶点汇总在一起,删除重复项,共得226靶点,构建活性成分潜在作用靶点库。从DisGeNET、TTD、GeneCards等数据库中搜索与血瘀疾病相关的靶点,将以上靶点汇总,删除重复项,共得490个靶点,以此构建疾病相关靶点库。

图2 ESI-模式下,化合物1的高能质谱图Fig.2 High-energy mass spectrum of compound 1 at ESI- mode

图3 ESI-模式下,化合物13的高能质谱图Fig.3 High-energy mass spectrum of compound 13 at ESI- mode

图4 ESI-模式下,化合物28的高能质谱图Fig.4 High-energy mass spectrum of compound 28 at ESI- mode

2.4 活性成分与抗血瘀靶点网络构建及分析

活性成分-抗血瘀靶点网络共包括71个节点,122条边,其网络图示于图6,外周的黄色节点代表活性成分,中间的其他颜色节点代表交集靶点,中间其他颜色节点与外周黄色节点的连线代表活性成分与靶点之间的作用关系。可以看出,同一个活性成分可以作用于不同的靶点,而同一个靶点也可以被不同的活性成分影响,表明活性成分之间并不是单独发挥作用的,它们之间相互影响,共同发挥作用。此外,对活性成分-抗血瘀靶点网络进行拓扑结构分析,以拓扑结构特征值“连接度”作为参考指标,选择连接度大于2倍中位数的节点,在此基础上结合“接近中心性”和“中介中心度”对筛选出来的节点进行二次筛查,挑选三者值均靠前的靶点作为关键性节点。共筛选出前列腺素G/H合成酶-1(Prostaglandin G/H synthase 1,PTGS1)、前列腺素G/H合成酶-2(Prostaglandin G/H synthase 2,PTGS2)、β-2肾上腺素能受体(β-2 adrenergic receptor,ADRB2)、雌激素受体(Estrogen receptor,ESR1)、凝血酶(Thrombin,TH)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(Peroxisome proliferator activated receptor gamma,PPARG)、毒蕈碱乙酰胆碱受体M3(Muscarinic acetylcholine receptor M3,CHRM3)等关键性节点,表明这些节点受多种活性成分的调节,推测其在注射液治疗血瘀中发挥了重要作用。

图5 ESI-模式下,化合物2的高能质谱图Fig.5 High-energy mass spectrum of compound 2 at ESI- mode

图6 丹参川芎嗪注射液活性成分-抗血瘀靶点网络图Fig.6 Danshen ligustrazine injection active ingredient-anti-blood sputum target network diagram

2.5 疾病靶点-疾病通路网络构建及分析

在DAVID数据库中,得到交集靶点富集的疾病通路,再根据文献筛选出10条与血瘀疾病相关的通路,图形化结果示于图7,图中气泡的大小代表该通路上富集靶点的个数,气泡颜色差异代表靶点在该通路富集程度的高低。在数据库中查找富集到10条通路的靶点,疾病通路与对应靶点的信息列于表2,根据查到的信息构建疾病通路-富集靶点网络图,示于图8。

图7 丹参川芎嗪注射液抗血瘀靶点KEGG富集气泡图Fig.7 KEGG enrichment bubble diagram of Danshen ligustrazine injection against blood stasis target

表2 血瘀通路及其对应的靶点Table 2 Blood stasis pathway and its corresponding target

图8 丹参川芎嗪注射液抗血瘀靶点-疾病通路网络图Fig.8 Danshen ligustrazine injection anti-blood sputum target-disease pathway network map

3 讨论

关于丹参川芎嗪注射液化学成分的研究,大多只在一种离子模式下采集而导致采集的化合物信息不全面[14],或通过人工识别碎片离子而导致鉴定化合物效率低且易遗漏[15]。本实验采用正、负两种离子模式扫描采集信息,并结合UNIFI天然产物分析平台,高效、快速地分析鉴定注射液中的化合物。研究发现,注射液中富含丹参素、原儿茶酸、咖啡酸、丹参酚酸等丹参水溶性成分,具有抗氧化、抗血小板活化、保护受损血管内皮细胞、保护缺血心肌细胞和缺血再灌注损伤的脑细胞等作用[16-20]。同时,检测到川穹中生物碱标志性成分川芎嗪,具有抗血栓形成、抗缺血再灌注损伤、保护心脑血管系统、保肝、肾等多方面的药理作用[21]。因此,推测该注射液具有活血化瘀作用。

在抗血瘀靶点-疾病通路网络图中可以观察到,靶点AKT1、MAPK1所涉及的通路最多,分别映射了9条、7条通路。AKT1是一种丝氨酸/苏氨酸激酶,在细胞代谢、细胞存活、细胞周期调控、转录调控等多种生物学过程中发挥着重要作用,参与炎症、癌症、糖尿病及心血管疾病等的发生、发展[22]。MAPK1是一种丝裂原活化蛋白激酶,作为多种生物化学信号的整合点,参与多种细胞过程,在心肌纤维化的发生发展中具有重要作用[23-24]。AKT1、MAPK1共同涉及PI3K-Akt信号通路、血小板活化通路、鞘脂信号通路、cAMP信号通路、mTOR信号通路、VEGF信号通路、MAPK信号通路,这些通路具有保护血管内皮[25,26]、抗血小板活化和聚集[27]、修复微血管损伤[28]、恢复并改善造血功能[29]、调控血管生成[30]等作用。因此,推测回调这些紊乱的通路是丹参川芎嗪注射液治疗血瘀的作用机制之一。

4 结论

本实验采用UPLC-Q/TOF MS技术与UNIFI天然产物分析平台相结合的方法,对丹参川芎嗪注射液化学成分进行快速分析鉴定,共鉴定出包括黄酮、醌类、酯类等40个化学成分,并筛选出其中的20个活性成分,涉及51个交集靶点,构建了活性成分-抗血瘀靶点网络图。通过DAVID数据库分析,预测出其中24个靶点,涉及10个通路与血瘀疾病有关,构建了抗血瘀靶点-作用通路网络图。本研究初步揭示了丹参川芎嗪注射液“多成分-多靶点-多通路”协同治疗血瘀疾病的作用机制,为进一步的药效物质基础研究和作用机制研究提供了理论依据。

猜你喜欢

川芎嗪丹参靶点
丹参“收获神器”效率高
维生素D受体或是糖尿病治疗的新靶点
肿瘤免疫治疗发现新潜在靶点
丹参叶干燥过程中化学成分的动态变化
川芎嗪治疗脓毒症的机制研究进展综述
丹参叶片在快速生长期对短期UV-B辐射的敏感性
丹参川芎嗪注射液治疗脑血栓的可行性探究
心力衰竭的分子重构机制及其潜在的治疗靶点
28例丹参川芎嗪注射液致不良反应应急处理措施及经验
川芎嗪对链脲佐菌素诱导糖尿病肾病的治疗意义