等温核酸放大技术在重金属检测方面的应用

李婷婷，王嫦嫦，白向茹，王利华，夏 定，战艺芳，姚 琪，郑思洁

武汉市农业科学院环境与安全研究所，湖北 武汉 430065

重金属通常是指密度大于4.5 g/cm3的金属［1］，其中一些重金属例如铁、锌、铜、钴、锰等在生命系统中起着重要作用，是人体生命系统所必需的微量元素，但是过量的重金属也会对人体造成危害。更重要的是，像汞、铅、铬、砷等重金属，即使是微量也会对人体以及环境造成严重危害，这些重金属对水和土壤污染难以被消解，随着时间的推移，它们会通过食物链在人类和动物体内过度积累，导致严重的疾病而危害生命［2］。因此，重金属的检测就显得十分重要。

传统的重金属的检测方法主要有色谱学、光谱学和电化学方法等［3］。而为了更及时、准确地对环境中的重金属进行检测，往往会涉及到一些痕量金属元素的分析，此时也对分析技术的灵敏性与准确性有了更高的要求，放大检测技术则常被应用来提高分析检测的灵敏度。核酸放大技术作为一种信号放大技术一直在分析检测中有着广泛且重要的作用。核酸信号放大技术是基于核酸自身所具有的扩增能力而开发的一种信号放大技术，通过一定的策略，使得一个靶标循环诱导探针产生很强的信号，提升了灵敏度。目前信号方法技术可分为等温扩增技术和热循环扩增技术两大类，等温扩增技术主要包括杂交链式反应（hybridization chain reaction，HCR）、链置换扩增反应（strand displacement amplification，SDA）、滚环扩增技术（rolling circle amplification，RCA）、催化发夹组装技术（catalytic hairpin assembly，CHA）等。热循环扩增技术主要包括聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）、连接酶链反应（ligase chain reaction，LCR）和 核 酸 序 列 扩 增（nucleic acid sequence amplification，NASA）等［4］。

由于核酸信号方法技术的简便性和可操作性，已成为目前生化分析等领域中越来越重要的研究内容，同时，由于核酸具有的在特定物种识别方面的能力［5］使其在食品检测［6-8］、临床［9-11］、环境监测［12-14］等多个领域有着广泛的应用前景，可以实现对DNA［15-16］、RNA［17］、蛋白质［18-19］等超低浓度的检测，具有高灵敏度和选择性。而当前，由于一些功能核酸的发现，如可以与汞离子特异性识别 的 富T 序 列［20］、铅 离 子 依 赖 的“8-17”DNAzyme［21-22］等更使得核酸放大技术被广泛的应用与重金属检测的方法构建中。本文则主要介绍等温核酸扩增技术在重金属检测中的应用，通过分析不同类别的等温核酸放大技术在重金属检测的设计原理及思路，探讨等温核酸放大技术在重金属检测中的应用前景。

1 杂交链式反应在重金属检测方面的应用

杂交链式反应是一种由Dirks 和Pierce 在2004 年首次提出的无酶等温扩增技术［23］。该反应设计了两种部分互补的发卡DNA 探针H1 和H2，在无引物链的存在下，这两种探针可以稳定互存，当加入引物链I 之后，引物I 会与H1 部分杂交使得H1 的发夹结构被打开，H1 释放出的另一端则可以与H2 部分杂交，将H2 的发卡结构也打开，而打开的H2 的另一端可与H1 再一次杂交，之后可进行不停的杂交形成具有刚性的双链结构，实现信号放大与检测。HCR 过程无需酶的参与，在常温下即可反应，具有操作简便、经济等优点。

Cai 等［24］利用Hg2+诱导的Mg2+特 异性DNA酶（Mg2+-DNAzyme）激活进行靶循环和HCR 在电极上引入一层DNA 水凝胶用于检测Hg2+的电化学阻抗生物传感器，如图1 所示，在目标物Hg2+的存在下，Hg2+激活Mg2+-DNAzyme，选择性切割底物，释放出一端单链DNA，从而引发HCR 反应，并在电极表面组装了一层DNA 交联水凝胶，该方法对Hg2+的检测限可达0.042 pmol/L。Hong 等［25］同样利用电化学方法构建了对汞离子的高灵敏检测，通过电极上构建T-Hg2+-T 结构，触发NEase 对识别位点的反应，得到HCR 引发链，之后与亚甲蓝（methylene blue，MB）标记的发夹状信号探针（S1和S2）反生HCR 反应，构建了刻痕双螺旋共聚物，实现对Hg2+的检测。

图1 结合DNA 酶和杂交链式反应检测Hg2+的生物传感器Fig.1 Biosensor for Hg2+detection by DNA enzyme and hybrid chain reaction

Hao 课题组［26］利用T-Hg2+-T 碱基对的形成引发HCR 反应，得到含有大量G-四链体的双联DNA，之后在氯化血红素存在下，具有催化活性的氯化血红素/G-四链DNA 可以催化H2O2氧化ABTS 为绿色阳离子自由基ABTS·+，从而通过比色分析实现汞离子的检测，其原理如图2 所示。Tang 等［27］同样开发了一种比色检测汞离子的方法，利用T-Hg2+-T 作用引发HCR 反应构建银纳米线，银离子可催化形成紫红色的高锰酸钾，通过颜色变化达到对汞离子的检测作用。

图2 基于杂交链式反应的Hg2+的比色检测方法Fig.2 Hg2+colorimetric detection method based on hybrid chain reaction

Huang 课 题 组［28］则 利 用T-Hg2+-T 作 用 引 发HCR 反应构建了一种用于汞离子检测的荧光生物传感器，并利用氧化石墨烯（graphene oxide，GO）实现“开关”，在无汞离子存在时，GO 会吸附DNA探针，使探针上的荧光猝灭，当汞离子存在时，通过形成T-Hg2+-T 结构引发HCR，得到的DNA 双链从GO 上脱离使荧光恢复从而达到对汞离子的检测目的。Sui 等［29］通过在磁性氧化铁（Fe3O4）纳米颗粒表面修饰一段核酸适配体，以汞离子作为目标物，当溶液中不存在汞离子时，该适配体可以引发HCR 反应得到一段DNA 双链，之后加入荧光指示剂SYBR Green，它可以插入DNA 双链中，随后再引入Ag@SiO2纳米颗粒增强SG 的荧光从而达到检测的目的。

Zhuang 等［30］基于HCR 和铅特异性的DNA 酶构建了一种磁控电子开关，用于铅离子的灵敏检测。在铅离子存在下，DNA 酶中底物DNA 片段发生裂解，释放出捕获链与二茂铁标记的发夹DNA发生HCR 反应，在磁珠上形成刻痕的双螺旋，该产物在外加电位下产生电化学信号，通过监测电化学信号的变化，可以间接测定铅离子浓度。Zhang课题组［31］也开发了一种基于磁性纳米材料标记杂交链式反应的电化学传感器，实现对银离子的检测。通过在Fe3O4@Au 纳米材料表面标记一段DNA，在银离子存在下，该DNA 可以与另外一段寡核苷酸部分杂交形成分子内双链，多余的部分可以与二茂铁标记的发夹DNA 发生HCR 反应，形成带有刻痕的双螺旋，之后将该产物富集在磁性金电极上进行电信号检测达到对目标物分析的目的。Gu 等［32］则在金电极上构建HCR 反应，产生巨大的电荷转移电阻（charge transfer resistance，Rct），之后引入As3+可与HCR 产物特异性结合，使HCR 产物被释放降低了Rct，随后加入RecJf 核酸外切酶催化降解可进一步提高Rct，通过Rct的变化反映As3+的浓度水平。

2 链置换扩增技术在重金属检测方面的应用

链置换扩增技术是由Walker 等［33］在1992 年首次提出的一种恒温DNA 扩增方法，主要靠核酸内切酶和与DNA 聚合酶协作完成。该技术的原理是利用寡核酸链与含有核酸内切酶的识别位点的引物杂交，在DNA 聚合酶和dNTPs 的存在下产生一段具有核酸内切酶识别位点的双链DNA，而核酸内切酶可以识别并切割位点从而得到一段目标单链DNA，而DNA 聚合酶则可在缺口处继续复制延伸DNA 片段，又重新产生一条具有酶切位点的DNA 双链，此过程经过循环往复便产生大量目标DNA。SDA 可常温操作，具有灵敏度高等优点。

Liu 等［34］开发了一种基于SDA 检测汞离子的比色方法，如图3 所示，该方法利用T-Hg2+-T 结构构建开关触发SDA 反应，反应中无酶参与，得到的SDA 产物可以与金纳米探针结合导致金纳米粒子聚沉，使溶液颜色从红色变为无色，从而实现对汞离子的检测，该方法用加标回收的方法验证了其在实际样品中的应用价值。Xie 等［35］同样利用THg2+-T 结构触发SDA 开关，得到的SDA 产物可以与金电极上标记的含有G 四链体的发卡DNA 结合形成Mg2+依赖的DNA 酶，随后在Mg2+存在下该酶发生裂解并将G-四链体片段留在电极表面，之后通过构建氯高铁血红素/G-四链体重复单元作为信号输出的介质实现对汞离子的检测，该方法在水样中加标分析回收率为96.5%～108.0%，表明这种方法对实际样品中Hg2+的测定的可行性。

图3 利用链置换扩增的Hg2+比色检测方法Fig.3 Hg2+ colorimetric detection method by chain displacement amplification

Li 等［36］建立了一种基于DNA 酶的铅离子定量方法，在Pb2+存在下，DNAzyme 切割了一个含有DNA 底物的RNA，释放单链DNA 作为引物进行链置换扩增反应，将荧光染料作用于反应产物，实现对铅离子的检测，该方法具有良好的选择性，检出限为200 pmol/L。Chen 等［37］建立了一种基于DNA 酶与链置换扩增技术的新型荧光传感器对铅进行超灵敏检测。在Pb2+存在下，特异性DNA 酶被剪切，产生DNA 单链可以连续引发两次链置换扩增反应，得到的目标链可以被石墨烯吸附使得修饰的荧光基团淬灭，而与其互补链杂交后，双链上的荧光团可以恢复荧光，荧光增量则与铅离子浓度相关，该反应可以达到6.7 pmol/L 的检出限，其加标回收率为96.67%～107.36%。

3 滚环扩增技术在重金属检测方面的应用

滚环扩增技术有线性扩增和指数扩增两种形式［38-39］，它是借鉴病原体的滚环复制而提出的。该技术以环形单链DNA 为模板，在特殊DNA 聚合酶的作用下可产生与环状DNA 模板互补的大量单链DNA，从而实现信号的放大。RCA 常用的聚合酶有BstDNA 聚合酶、phi29 聚合酶等，该反应可在常温下进行，并且具有较高的稳定性，已被广泛应用于DNA、RNA、蛋白质等物质的分析检测，该反应在重金属检测方面亦有应用。

Tang 课题组［40］利用RCA 和DNA 酶发明了一种铅离子的电化学检测方法，如图4 所示，当目标物铅离子存在时，它可以识别修饰在特异性磁珠上的DNA 酶使其裂解释放催化链引发RCA 反应，之后该产物可与镉量子点修饰的单链DNA 杂交，通过测定杂交的镉离子的浓度实现对铅离子的检测，该课题组将该方法用于自来水中加标回收实验，得到回收率为97.3%～108.0%，表明该方法对实际水样中Pb2+的检测具有很大的应用潜力。LÜ等［41］研发了一种电化学测定Hg2+的高效靶转换策略，在目标物Hg2+存在条件下，它可以与磁珠上修饰的DNA 链杂交，释放RCA 引物引发RCA 反应，RCA 产物可与金电极上修饰的DNA 链部分杂交，之后，利用亚甲基蓝作为电子介质，通过与反应产物静电结合的相互作用，获得显著的检测信号，该方法的回收率在99.0%～100.4%之间，表明该方法可用于实际样品分析。Qian［42］课题组利用RCA研发了一种铅离子的检测，当Pb2+存在时，磁珠表面DNA 酶发生部分裂解释放出单链DNA 可触发RCA 反应，形成大量的寡核苷酸重复序列，随后，这些重复序列与葡萄糖氧化酶标记的单链DNA杂交，并伴随着pH 值的下降，通过测量pH 的变化实现对铅离子的检测。该方法与ICP-MS 进行了比较，有较好的一致性。

图4 基于滚环扩增和量子点标记的Pb2+检测方法Fig.4 Pb2+detection method based on rolling ring amplification and quantum dots tagging

4 催化发夹组装技术在重金属检测方面的应用

催化发夹组装技术是一种无酶参与的核酸放大技术，由Pierce 课题组［43］在2008 年第一次提出。它是利用不同的编程方法发挥引发链的催化功能，在形成双链结构之后，引发链被释放，从而进入下一轮的催化发夹组装，实现目标链的信号放大。CHA 反应不需要酶的辅助，仅仅通过DNA 编码自组装，就能完成对目标物的超灵敏检测，被广泛应用于分析检测领域。

Zhao 等［44］研发了一种基于CHA 的电化学生物传感方法用于Pb2+的检测，如图5 所示。该方法设计在目标物Pb2+存在下，Pb2+特异性DNA 酶被Pb2+识别切割，释放引物链，它可以与电极表面的发夹DNA 杂交引发CHA，之后通过引入Pt@PdNCs 和锰卟啉还原H2O2，实现了Pb2+生物传感器的有效信号放大，该方法在水样中加标回收率为94.7%～105.0%。Jin 等［45］以催化发夹组件为信号放大元件，研制了一种用于铅离子检测的电化学传感器。在铅离子存在的情况下，设计引发CHA 反应，在电极上合成一端标记有生物素的DNA 双链，之后通过与负载铂纳米颗粒的生物质多孔碳结合催化对苯二酚的氧化，实现电化学信号检测，该方法的加标回收率在93.5%～108.0%范围内。Yun［46］课题组研发了一种基于氧化石墨烯（GO）和CHA 检测Hg2+的方法。3 个荧光标记的发夹DNA 探针可以通过π-π 堆积紧密地吸附在GO 表面，从而抑制荧光信号，当引入汞离子后，利用T-Hg2+-T 相互作用使发卡打开并诱导发夹的催化自组装，形成的含有双链DNA 的刚性DNA 从GO 表面脱落，从而产生荧光信号，该方法对Hg2+具有良好的选择性，其加标回收率为94.0%～103.1%，在实际样品中有很好的应用前景。

图5 基于催化发夹组装的Pb2+检测方法Fig.5 Pb2+detection method based on catalytic hairpin assembly

5 总结与展望

本文对等温核酸放大技术在重金属检测方面的应用进行了阐述与分析。随着社会快速的发展，工业废物、生活垃圾的剧增以及农药和化肥的大量使用，土壤、水体等遭受到了越来越严重的重金属污染。因此，研发出快速、高效的重金属检测方法越来越重要。核酸放大技术作为一种信号放大方法，具有灵敏度高、操作便捷、成本低、绿色无污染等特点，是今后环境安全检测等领域的研究热点。目前基于核酸信号放大技术进行重金属的检测主要是利用功能核酸，以及结合纳米材料、荧光探针等物质实现高灵敏度的检测，并且具有很高的稳定性和特异性，因此该方法具有很大的应用空间。但是由于目前合成出的功能核酸的种类有限，主要包括可以特异性识别汞离子的富T 序列、可以特异性识别银离子的富C 序列以及一些特异性脱氧核酶、适配体等等，因此，利用核酸放大技术检测重金属依然有一定的局限性，未来有必要开发出更多的重金属功能核酸。另外该技术目前大多停留在实验室阶段，对于实际应用仍有一定局限性，因此开发出适合实际应用的检测方法仍是今后科研工作者的重点研究方向。