血液滤过联合乌司他丁对脓毒症患者脏器功能及炎性因子的影响

李爱军 苗进昌 高艳玲 张坤 曹志娇 秦莉

脓毒症对人类的健康构成了严重威胁。脓毒症常常继发于烧伤、严重感染、创伤、术后等情况，也是其主要死亡原因[1,2]。脓毒症的国际共识认为，脓毒症是机体在感染后出现的炎性反应(SIRS)与抗炎反应(CARS)失调而导致的多器官功能衰竭(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)，危及患者的生命[3]。这个定义直接反映了脓毒症的病理生理过程，有利于对脓毒症的快速识别，提高脓毒症的临床诊断率，指导临床医生对它的治疗。机体任何部位在感染了病原微生物后，都可能发展成为脓毒症。尤其是老年和患有基础疾病的患者，泌尿系统、呼吸系统、血液系统、消化系统等部位是细菌病毒及非典型病原体的易感部位，所以这些患者的感染常导致全身炎性反应综合征，进而发展成为脓毒症、感染性休克和多脏器衰竭。近年来，大量动物实验对脓毒症的病理生理机制进行了深入的研究，临床诊断方法、治疗手段不断提高，但该病的发病率和死亡率仍然很高。既往有研究发现，血液滤过(CVVH)和乌司他丁(Ulinastatin)在清除体内毒素和炎性细胞因子方面有显著作用，同时还能够改善血管内皮细胞的损伤[4]。但该方法联合对脓毒症患者的治疗效果尚不清楚。因此本研究采取随机、对照的方法，选取在我院就诊的、符合入选条件的脓毒症患者240例，使用上述方法进行治疗，探讨其对脓毒症患者的作用机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2012年1月至2018年12月、符合入选标准的患者240例。依据电子计算机随机数的方法分为对照组、血滤组、联合治疗组，每组80例。对照组：男43例，女37例；平均年龄(65.3±6.1)岁；既往史：冠心病19例，肾功能损伤27例，肝功能障碍10例，糖尿病病史24例。血滤组：男41例，女39例；平均年龄(62.1±5.9)岁；既往史：冠心病17例，肾功能损伤25例，肝功能障碍15例，血糖升高符合糖尿病诊断标准23例。联合治疗组：男38例，女42例；平均年龄(67.0±7.1)岁；既往史：冠心病21例，肾功能损伤27例，肝功能障碍13例，糖尿病患者19例。3组患者年龄、性别比、基础疾病等差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。经医院伦理委员会论证，符合医学伦理学要求。患者进入试验前向家属告知研究目的及背景，由于本试验标本的采集仅为抽血检查，不会给患者带来任何伤害。有试验经费做保障，不增加患者额外的经济负担，同时保护患者隐私，不向外界泄露患者个人身份信息和医学信息。

1.2 纳入与排除标准

1.2.1 入选标准：①医院治疗>36 h；② 80岁>年龄>20岁；③满足第三版脓毒症国际共识发布的诊断标准[5]：体温>38℃或<36℃，白细胞计数>12.00×109/L,PaCO2<32 mm Hg或呼吸频率>20次/min，心率>90次/min；④参照“2018中国脓毒症休克(septic shock)急诊治疗指南”的诊断标准[5]：积极补液后，血压仍不能维持，在应用血管升压药物后，平均动脉压维持在>65 mm Hg，血乳酸(lactic acid)>2 mmol/L，即可诊断为脓毒症休克；⑤确定感染的患者，3分

1.2.2 排除标准：①1个月内使用过激素、免疫抑制剂等药物的患者；②既往有恶性肿瘤的病史；③机体患有严重的免疫系统疾病(如：系统性红斑狼疮、艾滋病等)；④精神异常患者；⑤入院后不足96 h，自动放弃治疗和死亡出院的患者；⑥将课题研究的方法及目的明确告之病患和家属，明确表态不愿意参加的；⑦诊断、检查及用药等资料缺失的病例。

1.3 方法

1.3.1 对照组：按照《拯救脓毒症指南》和《第三版脓毒症国际共识》的建议给予基础治疗，尽快液体复苏，入院后6 h内，使中心静脉压维持在1.07～1.60 kPa，平均动脉压>8.67 kPa，尿量>0.5 ml·h-1·kg-1体重，中心静脉血氧饱合度>70%，同时给予积极抗感染及营养支持等对症治疗[6]。

1.3.2 血滤组：患者采用股静脉及颈内静脉建立血管通道，留置ARROW中心静脉导管(双腔CS-22502-5Fr×5 cm，18～20 Ga，无蓝空针)，采用金宝(Grmbro)公司GBS21-LH87A血液净化系统行CVVH治疗，滤器使用带有负电的膜材，型号为：NA69-ST，总面积1.5 m2，管路型号：TAC-65-KL，血流速控制150～200 ml/min，动脉压-400～-100 mm Hg，患者从入院到血滤开始的平均时间为(126.18±3.96)h，血滤治疗的平均时间(87.26±4.43)h。置换液在滤器前分别采用二路液补充，流速约3 500 ml/h。一路液配方为：注射用水1 500 ml、0.9%氯化钠2 500 ml、50%葡萄糖30 ml、10%氯化钾15 ml、10%氯化钙7 ml、25%硫酸镁5.0 ml；另一路液为5%碳酸氢钠120 ml、0.9%氯化钠溶液380 ml。置换液在配制过程中还要根据患者内环境的酸碱电解质情况进行适当调整。在CVVH中，患者的脱水量依据体内的液体负荷来确定。根据凝血指标使用肝素抗凝，肝素盐水用1 000 ml 0.9%氯化钠加10 000 U肝素钠配制。在行CVVH前，为防止管路凝血，首先使用肝素盐水对机器进行预冲0.5 h。给患者肝素负荷量12 U/kg，然后持续泵入8 U·kg-1·h-1。每2小时抽血查APTT时间，调整肝素用量。在入组患者中，因凝血异常8例，进行无肝素的CVVH治疗。

1.3.3 联合治疗组：除进行CVVH治疗外，给予乌司他丁50万U溶于0.9%氯化钠100 ml静脉滴注，2次/d，乌司他丁由广东天普生化医药股份有限公司生产。

1.4 观察指标

1.4.1 病情严重程度评分:患者开始治疗前及治疗96 h后最差的功能指标，按照美国华盛顿大学医学院Knaus教授制定的急性生理与慢性健康(APACHEⅡ)评分以及欧州重症医学会提出的序贯器官功能衰竭评分(SOFA)等级进行量化打分。

1.4.2 肝肾功能检测:患者入院后，治疗前及治疗96 h 由上肢静脉抽血，5 ml放入血常规管，5 ml放入肝素生化管，低温条件下，4 500 r/min的速度进行离心0.5 h，取出血清在超低温(-80℃～-70℃)的冰柜中保存。采用日本东亚公司生产的Sysmex RX-35电阻抗脉冲血细胞分析仪进行白细胞WBC检测。放射免疫分析法(RIA)测定降钙素原PCT，检测采用德国勃拉姆斯公司生产的Bramhms AF-365型试剂盒，广州华科万孚科技有限公司生产的ZF431型免疫定量检测系统。免疫荧光定量法检测C-反应蛋白(CRP)的含量，将血样加入检测缓冲液中，血清中CRP与缓冲液中带有荧光标记的抗体结合，形成抗原-抗体复合物，复合物中的荧光强度代表了血清中CRP的含量，用微量移液枪将该复合物注入到i-RNQAZH Founder免疫荧光分析仪中进行处理，即可检测到样本中CRP的含量。生化指标[包括：丙氨酸转氨酶(ALT)、门冬氨酸转氨酶(AST)、部分活化凝血酶原时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、总胆红素(TB)、间接胆红素(IB)、肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)]检测使用Olympus AP-6500型全自动生化分析仪，试剂由武汉华科生物技术有限公司生产。

1.4.3 酶联免疫吸附法(ELISA)检测血浆中TNF-α、IL-6、IL-13的含量：患者治疗前及治疗96 h后外周静脉采集EDTA抗凝血3 ml，放入低温(4℃)超高速(8 000～10 000 r/min)离心机中离心20 min，超低温(-80℃～-70℃)冰箱内保存，以备检验。使用北京百奥莱博科技有限公司生产的TGP065 ELISA试剂盒，严格按照说明书要求进行操作。使用德国默赛生产的飞酶标比色仪SH11/GF-M2000测定(OPD 用 492 nm)OD 值。

2 结果

2.1 3组患者脏器功能损伤评分比较 3组患者治疗前及治疗96 h后APACHEⅡ评分和SOFA评分较治疗前均降低，差异有统计学意义(P<0.05)。CVVH治疗后，血滤组和联合治疗组患者的APACHEⅡ和SOFA评分较对照组下降，差异均有统计学意义(P<0.05)。联合治疗组患者加用乌司他丁治疗后，患者的脏器功能APACHEⅡ和SOFA评分显著降低，与对照组和血滤组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 3组患者脏器功能损伤评分比较 n=80,分,

2.2 3组患者炎性指标比较 3组患者治疗96 h后，血清中WBC、CRP、PTC的水平均明显降低，与治疗前比较差异均有统计学意义(P<0.05)；血滤组患者应用CVVH治疗后，与对照组患者比较，差异有统计学意义(P<0.05)；应用乌司他丁治疗后，联合治疗组患者的WBC、CRP、PTC较对照组和血滤组均显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 3组患者炎性指标比较

2.3 3组患者血液生化指标比较 治疗96 h后，患者血液中ALT、AST、TB、IB、Cr、BUN的含量较治疗前均有不同程度的下降，差异有统计学意义(P<0.05)；应用CVVH治疗后，血滤组肝肾功能指标较对照组明显好转，2组比较差异有统计学意义(P<0.05)；联合治疗组应用乌司他丁后，肝肾功能指标好转更加显著，与对照组和血滤组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 3组患者血液生化指标比较

2.4 3组患者炎性细胞因子TNF-α、IL-6、IL-13水平比较 3组患者治疗后，血浆中TNF-α、IL-6、IL-13的含量均明显下降，与治疗前比较差异有统计学意义(P<0.05)。血滤组患者治疗后，与对照组比较，3种炎性细胞因子下降显著，差异有统计学意义(P<0.05)。联合治疗组患者加用乌司他丁后，血浆TNF-α、IL-6、IL-13的水平进一步降低，与对照组和血滤组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 3组患者炎性细胞因子比较

3 讨论

脓毒症是临床上常见的急危重症，也是ICU患者死亡的主要原因之一。脓毒症的发病与应激、氧化、凋亡、神经免疫、肝脏、肾脏、内分泌等多系统调控密切相关。基础实验和临床研究均证实，脓毒症是感染诱发的多系统反应的结果，机体在严重感染后，免疫、内分泌等系统迅速被调动，引起炎性因子的瀑布式级连反应，产生大量的炎性介质，通过自分泌、体液分泌等形式释放出来，在炎性反应的同时，抗炎物质也大量产生，因此出现了宿主对感染的严重失衡，这种炎症和抗炎介质的过度释放对机体产生的损伤要比单纯感染严重的多[7]。伴随着对脓毒症研究的深入，人们越来越关注细胞因子对脏器功能的损伤(MODS)，它们之间的关系也成为当前脓毒症研究的热点。已有研究表明，这些炎性因子的产生与体内的巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞等免疫细胞的活化有直接关系[8]。在关于脓毒症的前期研究中发现，脏器中炎性细胞因子的聚集以及在脏器局部的活化、激活、氧化反应和抗氧化反应的失衡是脓毒症脏器功能衰竭的病理生理学基础[9]。因此只有阻断炎性细胞因子产生的途径，减少器官脏器中炎性因子的含量，才能预防脓毒症相关的MODS的产生。本试验中我们具体考查TNF-α、IL-6、IL-13在脏器功能损伤中的作用。

TNF-α是人体抵抗病原微生物的关键因素，由单核巨噬细胞、淋巴细胞及内皮细胞等免疫细胞产生和释放，它是炎性反应中产生最早的细胞因子，也是炎症级联反应的启动因素，在导致器官损伤的病理过程中，它贯穿其中并起重要作用[10]。主要表现在以下方面：(1)在细胞内通过电子传递产生氧自由基，启动细胞凋亡程序，活化核酸内切酶破坏组织细胞DNA，导致细胞的死亡。(2)能够诱导如IL-6、IL-13、TGF-β等其他炎性细胞因子的产生、释放和迁移，炎性因子在器官局部呈现高浓度，加重局部炎症。(3)TNF-α损伤血管内皮细胞，促使中性粒细胞与受损的内皮细胞粘附，进一步损伤内皮细胞，同时激活血管内凝血，抑制纤溶系统，形成血管内微血栓，破坏组织器官的血液循环。IL-6作为白细胞介素家族的一员，属于促炎因子[11]。当机体出现炎性反应时，可以转导细胞内信号，诱导细胞产生急性期反应蛋白，同时对其它炎性因子起到趋化、聚集的作用。它协同TNF-α、IL-2等细胞因子诱导T/B淋巴细胞的分化、增殖，还促使IL-3对多向祖细胞的诱导与分化[12]。有研究发现，IL-6也可以通过细胞内STAT3信号通路调节细胞的生长和凋亡[13]。IL-13属于白细胞介素-1家族，在感染应答刺激下，由内皮细胞、成纤维细胞、单核细胞等炎性细胞产生和释放，通过激活IL-2、血小板生长因子、集落刺激因子等因子参与免疫应答，促进B淋巴增殖及分泌。在我们的实验中，细胞因子TNF-α、IL-6、IL-13在3组脓毒症患者治疗前均呈现高表达，相同时段，反映肝肾功能的指标ALT、AST、TB、IB、Cr、BUN也都明显高于正常值。充分证明了脓毒症脏器功能损伤与炎性因子的体内浓度明显相关。

WBC、CRP、PCT是临床常用于诊断感染的指标。WBC反应机体对炎性反应的能力，当出现中度以上感染时，WBC明显上升，常常同时伴有核左移。CRP由肝脏产生，受TNF-α、IL-6等因子的调节，在感染后，在体内的浓度迅速上升，作为炎性反应急性期时相蛋白，可用于评估患者病情轻重及转归。PCT是降钙素的无活性肽链，由116个氨基酸组成[14]。谭德敏等[15]对9 846 例按照美国重症医学会/欧洲危重症医学会发布的拯救脓毒症运动(2016)标准诊断为脓毒症的患者进行了研究，结果显示PCT对脓毒症诊断的特异性为0.75，敏感性为0.81。

SOFA、APACHEⅡ在临床上常用于对患者脏器功能的评估，该评分系统具有操作简单、持续动态、无创可靠、容易观察等特点。评分高低与患者病情危重程度成正相关，不仅描述了多脏器功能衰竭患者的病理发展过程，而且对患者预后进行准确的预测。为临床快速诊断和治疗提供了量化指标。

目前，脓毒症的治疗效果差，临床病死率高，并且治疗花费大，脓毒症治疗的方法包括：以液体复苏为主的目标导向治疗(EGDT)、血管活性药物、抗生素、激素等，但仍不能显著的提高治愈率，究其原因，是炎性因子网络和炎症级联反应的复杂性导致的。

连续静脉-静脉血液滤过(continuous veno venous hemofiltration,CVVH)属于肾脏替代治疗的一种，它采用高分子滤膜过滤器，利用血液对流的原理清除体内中小分子毒物，如BUN、Cr等，同时它还可以清除体内的细胞因子和炎性介质，调节水、电解质平衡紊乱，模拟正常肾脏对血液的滤过作用，精准的对机体内环境进行调控，因此被广泛应用于急危重症的治疗。本研究结果显示，血滤组患者SOFA、APACHEⅡ评分均降低，血液中WBC、CRP、PCT和炎性因子TNF-α、IL-6、IL-13也显著下降，与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。

乌司他丁是一种广谱的蛋白酶抑制剂，对机体内多种酶，包括各种糖蛋白酶、纤溶酶、透明质酸酶、胰蛋白酶等都具有良好的抑制作用。动物实验及临床研究显示，乌司他丁具有清除机体氧自由基、抑制炎性因子的产生、释放、阻断炎性联连反应的作用，在脓毒症休克、DIC、MODF等全身性疾病中可以有效抑制单核巨噬细胞、淋巴细胞的激活，改善组织微循环及血液灌注，从而保护各个脏器功能[16]。

血液滤过联合乌司他丁不仅能够加强炎性细胞因子的清除，阻断全身炎性反应，而且还能清除尿素、肌酐等体内毒素，滤出体内多余的水分，对脏器功能起到保护作用。两者结合可以优势互补、强化清除效应，有利于改善病情。本试验中联合治疗组患者脏器功能评分SOFA、APACHEⅡ以及炎性指标WBC、CRP、PCT均低于对照组和血滤组，肝肾功能较对照组和血滤组明显改善，机体内TNF-α、IL-6、IL-13的含量下降显著，与对照组、血滤组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。

综上所述，血液滤过联合乌司他丁是针对脓毒症发病机制进行的多中心、多靶点的综合治疗，其不仅阻止了细菌产物及炎性细胞因子的产生和释放，而且还能清除体内的毒素和代谢产物，有效的改善了患者的器官功能，降低了脓毒症患者的病死率，在临床上疗效确切，不良反应少，值得推广。