黄芩汤通过调节ILC3s-Th细胞反应减轻小鼠的溃疡性结肠炎

周长琳，郑学宝，黄晓其，苏冀彦，李木霞，陈志维，李敏瑶，迟宏罡

1广东医科大学第一临床医学院，广东 湛江524023；2广州中医药大学中药学院，广东 广州510006；3东莞广州中医药大学中医药数理工程研究院，广东 东莞523000；4佛山市妇幼保健院南方医科大学附属佛山妇幼保健院科研实验室，广东 佛山528000；5广东医科大学第二临床医学院，广东 东莞523000

溃疡性结肠炎（UC）是一种慢性、复发性肠道炎症性疾病。UC 的常规治疗药物如5-氨基水杨酸、糖皮质激素、免疫抑制剂等存在停药后易复发,长期用药副反应多等缺点［1］。黄芩汤治疗UC的机制研究多集中于抗炎、调节免疫及肠道菌群等［2-5］，前期研究发现，黄芩汤能够调节UC大鼠Th细胞亚群细胞因子分泌的平衡，缓解实验大鼠症状［6-8］。但黄芩汤在治疗UC过程中具体通过哪些上游靶标来调节Th细胞亚群平衡有待进一步探讨。三型固有淋巴细胞（ILC3s）对UC发展过程中的Th细胞免疫反应具有重要的调节作用［9-11］，其通过主要组织相容性复合物Ⅱ类（MHCⅡ）分子依赖性方式提呈抗原，促进致炎性Th细胞凋亡，极可能成为UC治疗药物的潜在靶标［12-15］。ILC3s是否可能是黄芩汤的一个作用靶标，黄芩汤在治疗UC过程中调节Th细胞亚群平衡的作用是否与ILC3s有关，目前尚未有文献报道。本研究从ILC3s-Th细胞反应调控角度，通过检测结肠炎小鼠结肠组织ILC3s、Th细胞数目以及反映Th细胞功能的相关促炎性细胞因子如IL-2、IL-17A、IL-23、TNF-α、IFN-γ等，进一步阐明黄芩汤缓解溃疡性结肠炎的作用靶标。

1 材料和方法

1.1 实验动物

雄性Ba1b/c小鼠96只，6～8周龄，体质量约25 g，购于广东省医学实验动物中心，合格证号：SYXK（粤）2018-0002。实验动物饲养于广东省微生物研究所实验动物中心，室温20～24 ℃，相对湿度40%～70%。实验过程对小鼠的处理符合动物伦理学标准，已通过实验动物伦理审查。

1.2 实验药物及试剂

黄芩、白芍、大枣、炙甘草饮片（康美药业股份有限公司）；美沙拉嗪（ME 上海爱的发制药有限公司）；葡聚糖硫酸钠（DSS上海源叶生物科技有限公司）；苏木精、伊红、分化液、返蓝液（武汉赛维尔生物科技有限公司）、RPMI 1640培养基（Thermo fisher）；胶原酶Ⅳ（Sigma）、脱氧核糖核酸酶Ⅰ（广州菲博生物科技有限公司）、分散酶（上海源叶生物科技有限公司）；淋巴细胞分离液（达科为生物技术有限公司）；佛波酯、离子霉素、布雷非德菌素（杭州联科生物技术股份有限公司）；抗小鼠CD3、CD4、CD25、Foxp3、IFN-γ （BD Biosciences） ；Hematopoietic Lineage、CD127、MHCⅡ、RORgamma(t)的荧光抗体及Foxp3/转录因子固定破膜染色液组合和全蛋白提取试剂盒（北京索莱宝生物科技有限公司）、多因子测定试剂盒（Thermo fisher）。

1.3 仪器

GS-20 轨道式摇床（杭州米欧仪器有限公司）、L535R离心机（湘仪）、E-6000A旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器）、A1pha1-4LDp1us冻干机（博励行）、全自动HE染色机（Thermo fisher）ML-1600平板显微镜（武汉赛维尔生物科技有限公司）、FACSCantoⅡ流式细胞仪（BD Biosciences）、Gabaxy170S+CO2细 胞 培 养 箱（Eppendorf）、BSC-1800ⅡA2超净工作台（北京东联哈尔仪器邮箱公司）、IC1000自动细胞计数仪（上海睿钰生物科技有限公司）、IX71 显微镜（O1ympus）、Luminex200 液 相 芯 片 分 析 系 统（Mi11ipore）、ThermoMK3全波长酶标仪（Thermo fisher）。

1.4 黄芩汤制备

黄芩、芍药、大枣、炙甘草按质量比9∶6∶6∶49加入10倍蒸馏水浸泡30 min后加热至100 ℃，持续30 min，药液过滤；残余物用蒸馏水稀释8倍，相同条件下进行第2次提取。将2次提取液混合并旋蒸至浓度为1 g/mL的浓缩液，浓缩液冻干，所得冻干粉于干燥阴凉处保存备用。

1.5 动物造模及给药

将96只Ba1b/c小鼠按体质量随机分为6组，正常组、模型组（DSS）、美沙拉嗪组（ME，400 mg/kg）黄芩汤低剂量组（HL，2.275 g/kg）、黄芩汤中剂量组（HM，4.55 g/kg）、黄芩汤高剂量组（HH，9.1 g/kg），每组16只。除正常组外，其余各组小鼠自由饮用3%DSS溶液，同时黄芩汤组小鼠每日予0.1 mL/mg黄芩汤灌胃，正常组及模型组0.1 mL/mg蒸馏水灌胃。各组正常自由饮食。造模及给药持续7 d。

1.6 一般状况及疾病活动指数（DAI）评分

造模期间每天观察小鼠活动状态、精神状态、毛发光泽度，记录饮食及饮水量，并每天记录小鼠粪便性状、血便及体质量，参照Su等［22］的评分标准进行DAI评分（表1）。

表1 DAI评分标准Tab.1 Criteria for DAI scoring

1.7 结肠宏观评分

实验第8天颈椎脱臼处死小鼠，剖取结肠，测量结肠长度，观察有无水肿、充血、组织黏连，然后纵向剖开结肠，观察溃疡、坏死情况，并进行评分，0分：无水肿、充血、粘连及溃疡点，1分：局部有水肿、充血或粘连，并且每增加1个溃疡点增加1分。

1.8 各组小鼠结肠组织病理观察

切取一块病变结肠组织约0.5 cm，10%甲醛溶液固定，常规石蜡包埋并切片（3 μm），组织切片用苏木素及伊红染色，然后依次片放入从低到高浓度的乙醇和二甲苯进行脱水，中性树脂胶封片并于显微镜下观察结肠组织变化。

1.9 结肠上皮及固有层淋巴细胞提取

将各组1～10号小鼠结肠纵向剖开，PBS清洗肠内容物，于六孔板每孔中加入7 mL含5 mmo1/L EDTA2Na及1 mmo1/L DTT的RPMI 1640完全培养基，并将各组内结肠两两合并放入其中剪成约0.2 cm大小，37 ℃恒温摇床上震荡30 min进行预消化。预消化结束后用200目无菌滤布过滤预消化液，并相同条件下重复预消化1次。收集2次预消化液离心（300×g，5 min，4 ℃），保存管底细胞。在剩余结肠组织中加入4 mL含0.5 mg/mLⅣ型胶原酶、0.02 mg/mL DNA酶Ⅰ、0.4 U/mL分散酶Ⅱ的RPMI 1640完全培养基，37 ℃恒温摇床上震荡1 h进行消化。消化结束后用200目滤布过滤消化液并离心（300 g，5 min，4 ℃），保存管底细胞。采用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，具体操作见说明书。

1.10 流式细胞术分析相关免疫细胞变化

1.10.1 ILC3细胞及MHCⅡ 分离的淋巴细胞转移至流式管，PBS洗涤。细胞表面蛋白的流式抗体孵育：流式管中加入含流式抗体FITC-HematopoieticLineage（Lin）、eF1uor450-CD127、PE-MHC Ⅱ的0.5% BSA/PBS，室温避光孵育30 min，PBS洗涤，使用固定破膜染色液组合进行固定并破膜。然后细胞与APC-RORγ(t)，室温避光孵育30 min。最后，加入100 μL0.5%BSA/PBS重悬细胞，上机检测，收集标记表面抗体阴性（Lin-）细胞，用Divasoftware（version6.0）对数据进行分析。

1.10.2 Th1、Treg细胞 在96孔板每孔加入含50 ng/mL佛波酯、1 μg/mL离子霉素、10 μg/mL 布雷非德菌素的RPMI 1640完全培养基，并加入分离的淋巴细胞，调整细胞浓度为1×107/mL，将96孔板放入37 ℃、5%CO2培养箱中培养6 h，转移含细胞的培养液于流式管中，PBS洗涤。细胞表面蛋白的流式抗体孵育：流式管中加入含流 式 抗 体FITC-CD3、PerCP-Cy ™5.5-CD4、BV510-CD25的0.5%BSA/PBS，室温避光孵育30 min，PBS洗涤，使用固定破膜染色液组合进行固定并破膜。然后细胞与BV421-Foxp3、PE-Cy™7-IFN-γ，室温避光孵育30 min。最后，加入100 μL 0.5%BSA/PBS 重悬细胞，上机检测，收集标记表面抗体阳性（CD3+）细胞，用Divasoftware(version6.0)对数据进行分析。

图1 小鼠的体征变化Fig.1 Changes of body weight(A)and DAI score(B)of the mice in the 6 groups(n=16).##P＜0.01 vs control group;**P＜0.01 vs DSS group.DSS: Dextran sulphate sodium; ME: Mesalazine; HL: Huangqin decoction low-dose; HM: Huangqin decoction medium-dose; HH:Huangqin decoction high-dose.

1.11 细胞因子检测

取各组11～16号小鼠结肠采用全蛋白提取试剂盒（北京索莱宝）提取总蛋白并检测蛋白浓度，按照多因子检测试剂盒（美国Thermo 公司）的说明书操作并用Luminex 200 液相芯片分析系统测定结肠组织中IL-17A、IL-23、IL-2、IL-13、IL-15、IL-4、TNF-α、IFN-γ含量，对细胞因子含量除以蛋白浓度所得数据进行分析。

1.12 数据分析

应用SPSS23.0统计软件进行处理，计量数据以均数±标准差表示，检测结果比较采用t检验或者单因素方差分析，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 黄芩汤缓解DSS诱导的炎症症状

造模期间DSS组小鼠出现懒动、精神状态差、毛发缺少光泽、饮食及饮水减少等症状，黄芩汤能够改善上述症状。图1结果显示正常组DAI评分为0，与DSS组评分（2.13±0.57）对比有差异（P＜0.05）；黄芩汤可显著降低小鼠的DAI 评分，其中HL 组（1.27±0.21）、HM 组（1.12±0.43）、HH组（1.26±0.32）与DSS组对比均有显著差异（P＜0.01）。

2.2 黄芩汤减轻DSS引起的结肠损伤

DSS诱导结肠炎后，受试小鼠结肠长度明显缩短，与正常组结肠长度相比，DSS 组结肠长度缩短（P＜0.01）。给予黄芩汤治疗后结肠长度明显延长，HL组结肠长度、HM组结肠长度、HH组结肠长度与DSS组对比均有差异（P＜0.01，图2）。正常组结肠宏观评分为0；而DSS组结肠有明显的水肿、充血、溃疡点及粘连情况，DSS组结肠宏观评分（6.88±0.89）与正常组相比有差异（P＜0.01）。给予黄芩汤治疗后结肠水肿、充血、溃疡点及粘连改善，宏观评分降低，HL、HM、HH组结肠宏观评分分别为3.00±0.85、2.73±0.88、2.69±0.85，与DSS对比均有显著差异（P＜0.01）。DSS 组结肠结构出现如肠上皮损伤、肠隐窝模糊、粘膜下层及肌层水肿等明显特征；ME组的结肠上皮被修复，粘膜下层和肌层的水肿明显改善，肠隐窝加深，但较正常组浅；而在HQD组中，除肠上皮、粘膜下层和肌层的损伤有明显改善，结肠的隐窝分支较少（图3）。

2.3 黄芩汤上调结肠ILC3s比例及其表达的MHCⅡ比例

图2 小鼠结肠长度变化Fig.2 Comparison of colon length of the mice among the 6 groups.A: Whole colon (from anus to cecum). B: Changes of colon length(n=16).##P＜0.01 vs control group;*P＜0.05 vs DSS group.

图3 小鼠结肠组织宏观及病理变化Fig.3 Macroscopic and pathological changes of the colon in the 6 groups(Original magnification:×100). A: Control group. B: DSS group. C: ME group.D:HL group.E:HM group.F:HH group.G:Changes of colonic macroscopic score in the 6 groups. n=16,##P＜0.01 vs control group; **P＜0.01 vs DSS group.

小鼠结肠组织ILC3s的结果如图4，与正常组小鼠结肠ILC3s比例[（27.83±3.39）%]相比，DSS组小鼠结肠上皮及固有层ILC3s细胞比例[（4.40±5.09）%]，显著减少（P＜0.01）。给予黄芩汤治疗后，HM、HH组与DSS组相比显著增加（P＜0.05）。DSS组ILC3s的MHCⅡ表达比例为[（0.92±1.2）%]，与正常组MHCⅡ表达比例[（6.89±3.18%）]相比显著减少（P＜0.01）。而黄芩汤可增加ILC3s的MHCⅡ表达比例，HL、HM、HH组MHCⅡ表达量分别为[（4.37±2.88）%]、[（4.02±0.46）%]、[（5.60±2.13）%]，与正常组相比HM组有差异（P＜0.05），HL、HH组差异显著（P＜0.01，图5）。

2.4 黄芩汤上调结肠Treg比例并下调Th1比例

图6与图7流式细胞术结果显示，DSS组Treg及Th1细胞比例与正常组相比无显著差异，HL、HM组较DSS组明显增加（P＜0.05，图6）。DSS组流式细胞结果显示HL、HM组与DSS组相比Th1细胞比例有显著差异（P＜0.01，图7）。

2.5 黄芩汤下调促炎细胞因子

多因子检测结果显示，DSS组小鼠结肠细胞因子IL-2、IL-4、IL-13、IL-15、IL-17A、IL-23、TNF-α较正常组明显升高（P＜0.05），IFN-γ较正常组有升高趋势（P=0.06）。HQD各剂量组可明显降低小鼠结肠IL-15、IL-17A、IL-23、TNF-α、IFN-γ含量（P＜0.05），同时HQD可降低IL-2、IL-4、IL-10、IL-13的生成（P＜0.05，图8）。

图4 流式细胞术分析各组结肠ILC3s比例的变化Fig.4 Flow cytometric analysis of the proportion of colonic ILC3s in the 6 groups.A:Representative plots.B:Statistical analysis(n=3-5).##P＜0.01 vs control group;*P＜0.05 vs DSS group.

图5 流式细胞术分析各组小结肠MHC II比例的变化Fig.5 Flow cytometric analysis of the proportion of colonic MHC II.A:Representative plots.B:Statistical analysis(n=3-5).##P＜0.01 vs control group;*P＜0.05 and**P＜0.01 vs DSS group.

图6 流式细胞术分析各组小鼠结肠Th1的比例变化Fig.6 Flow cytometric analysis of the proportion of colonic Th1.A:Representative plots;B:Statistical analysis.n=3-5,**P＜0.01 versus DSS group.

图7 流式细胞术分析各组小鼠结肠Treg的比例变化Fig.7 Flow cytometric analysis of the proportion of colonic Treg.A:Representative plots;B:Statistical analysis.n=3-5,*P＜0.05 vs DSS group.

3 讨论

黄芩汤是《伤寒论》的治痢经典名方［17］，临床上用于治疗溃疡性结肠炎［18］。在UC动物模型中，黄芩汤可通过调节Th细胞亚群的平衡显著缓解UC炎症症状［19-20］。本研究中，经黄芩汤治疗后，UC小鼠体质量增加，结肠长度增长，DAI评分降低，结肠炎症改善。此外，黄芩汤可通过上调ILC3s细胞的比例及MHCⅡ分子的表达，进而上调Treg细胞的比例和下调Th1细胞的比例，并降低多种促炎细胞因子的分泌，与本课题组的前期研究结果一致［6-7,19-20］，进一步说明黄芩汤能通过调节机体免疫功能达到治疗UC的功效。

图8 各组小鼠结肠细胞因子表达比较Fig.8 Expression of pro-inflammatory cytokines in the colon in the 6 groups.A:IL-2.B:IL-4.C:IL-13.D:IL-15.E:IL-17A.F:IL-23.G:IFN-γ.H:TNF-α.n=4-6,#P＜0.05 and##P＜0.01 vs control group.*P＜0.05 and**P＜0.01 vs DSS group.

本研究首次探讨了黄芩汤对DSS诱导的UC小鼠结肠组织ILC3s及其表达的MHCⅡ分子的调节作用。ILC3s能够不依赖细胞因子、抗原及微生物源性刺激并持续地表达MHCⅡ分子，通过MHCⅡ分子加工、提呈抗原，直接诱导效应性T细胞（Th1,Th2,Th17）凋亡，因此ILC3s的MHCⅡ依赖性抗原提呈过程能够调节Th细胞亚群的平衡［9］。动物实验表明，当敲除小鼠MHCⅡ基因后，小鼠体质量降低，出现明显结肠炎症，结肠长度缩短，脾质量增加，同时结肠组织中效应性T细胞比例显著升高［13-14］。有研究表明，在IBD患者结肠组织中，ILC3s细胞及其表达的MHCⅡ降低［14,21］。从文献报道来看，当ILC3s的MHCⅡ依赖性抗原提呈功能受损时，效应性T细胞的过度活化不能够被有效抑制，进而发生结肠炎症［13-14,21］。本实验的研究结果与上述文献研究的结论相一致，初步验证了黄芩汤通过上调ILC3s，增加MHCⅡ的表达进而发挥其免疫调节作用及抗炎药效，因此ILC3s及MHCⅡ可能成为黄芩汤调节Th细胞的上游靶标。

在UC患者的肠黏膜及UC小鼠的结肠中，存在效应性T细胞与调节性T细胞的失衡，效应T细胞过度活化并产生大量促炎性细胞因子［22-24］，如IL-2、IL-13、IL-15、IL-17A及IL-23，这些细胞因子可破坏肠上皮屏障、诱导效应性T细胞分化，也会促进其他促炎性细胞因子的分泌，因此机体中免疫细胞的失衡在UC的发生发展中起着重要作用［25-28］。抑制效应性T细胞相关促炎性细胞因子的表达，能够有效缓解小鼠UC症状［28］，前期研究表明，黄芩汤可调节UC小鼠结肠组织效应性T细胞及Treg细胞的平衡，降低促炎性细胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-4含量［30］。本实验还检测了Th细胞分泌的其他促炎性细胞因子如IL-2、IL-13、IL-15、IL-17A、IL-23，实验结果表明，黄芩汤可降低上述细胞因子的表达，进一步说明黄芩汤可抑制效应性T细胞的分化及功能，具有免疫调节及抗炎的药效。

综上所述，本研究利用DSS诱导的UC小鼠模型，探讨了黄芩汤可能通过调节ILC3s及MHCⅡ等Th细胞反应调节的可能上游靶标的表达，调节UC发展过程中病变部位微环境免疫稳态，发挥黄芩汤治疗UC的药效。本实验从ILC3s-Th细胞角度进一步探讨了黄芩汤缓解UC的可能作用靶点，阐释了中药复方治疗UC的可能作用机制，为黄芩汤的临床应用提供理论依据。