复杂样品的固相微萃取-直接质谱分析技术研究进展

郑亚君，路芳芳，张智平

(西安石油大学 化学化工学院，陕西 西安 710065)

质谱技术因具有灵敏度高、选择性好、特异性强等特点，已广泛应用于环境、生物、食品等各种复杂样品的检测分析。在诸多质谱分析方法中，色谱-质谱联用技术是现今复杂样品分析最权威、最可靠的方法，但这种技术在分析前需对样品进行繁琐的预处理，无法实现复杂样品的快速分析。为了解决这一问题，2004年美国普度大学Cooks教授[1]提出了常压离子化质谱(Ambient ionization mass spectrometry,AIMS)分析技术，该技术具有无需样品预处理、操作简单、分析时间短、可实现复杂样品的实时、快速检测等优点，现今已发展出不同类型的常压电离源技术，如解吸电喷雾电离源(Desorption electrospray ionization,DESI)[2]、实时直接分析(Direct analysis in real time,DART)[3]、纸喷雾电离源(Paper spray ionization,PSI)[4]等。虽然AIMS分析技术已广泛应用于不同领域，但其在复杂样品的电离过程中，基质中的干扰化合物(如金属盐)与待测目标化合物将同时被电离，在一定程度上严重抑制了待测化合物的高灵敏分析。为了提高对复杂样品的分析性能，有必要在AIMS分析前进行目标化合物富集或者样品基质的去除。

固相微萃取(Solid phase microextraction,SPME)是1990年加拿大滑铁卢大学Arthur和Pawliszyn[5]提出的一种样品制备技术，它将样品的采集、萃取、浓缩和分析整合为一步，极大地简化了样品的制备过程和分析流程，为复杂基质中目标化合物的高灵敏度分析提供了有效途径。固相微萃取是将少量固体吸附材料涂覆或键合在不同基体表面(如纤维、搅拌子、毛细管内壁、金属丝外壁等)，由于该技术无需溶剂、易于微型化、便于携带和自动化，已广泛应用于食品、环境、药品和生物样品等诸多领域[6-9]。将AIMS与SPME耦合，可实现复杂样品的快速、高灵敏度分析，现今已发展起来多种SPME-AIMS分析方式。本文系统总结了近年来新发展的可直接与常压电离源相联用或可原位电离目标化合物的固相微萃取技术，主要包括探针式、管内富集式、叶片式、网格式、表面涂层式、滤膜/滤纸分离式等，并详细论述了其工作原理及质谱分析性能，展望了该技术的发展趋势。

1 探针式固相微萃取

探针式固相微萃取(Probe-based SPME)是现今使用最为广泛的一种样品富集技术，其采样及样品解吸电离过程如图1所示。该技术首先是将吸附剂材料或化合物官能团负载在金属丝、金属针或纤维的尖端，然后在样品采集前采用合适溶剂对探针尖端的吸附材料进行活化和表面吸附杂质的去除，接着用其吸附复杂样品中的目标化合物，待吸附完成后再采用适当溶剂将探针吸附层表面的样品基质或干扰物洗涤，最后将探针吸附层放入含有喷雾溶剂的毛细管中进行原位解吸、电离以及质谱分析。采用该技术，人们已对不同复杂样品进行了快速、高灵敏度分析。如Deng等[10]通过二甲基十八烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]氯化铵修饰的金属探针对目标化合物进行富集，并将其与纳升电喷雾电离源(Nanoelectrospray ionization,nanoESI)相联用分析了大型蚤卵细胞中的全氟辛基磺酸和全氟辛酸化合物，检出限可达20～30 pg·mL-1。Hou等[11]采用共价有机框架材料涂覆的金属探针富集环境水样和血样中的氟烷基化合物，然后与纳升电喷雾质谱分析相结合，可在1～5 000 ng·L-1质量浓度范围内分析水样中14种氟烷基化合物，线性相关性良好，检出限为0.02～0.8 ng·L-1。Gómez-Ríos等[12]采用生物兼容性的C18-SCX修饰金属探针分析了不同生物样品(如磷酸盐缓冲溶液、尿样、血样)中的多种药物化合物，每个样品的分析时间小于2 min，分析灵敏度可达30～100 pg·mL-1。Zhao等[13]采用纳米TiO2修饰的金属探针富集胰蛋白酶解β-酪蛋白和牛血清蛋白中磷酸肽，然后将探针直接放入纳升电喷雾毛细管中对目标化合物进行解吸和质谱分析，发现该方法对复杂生物基质中磷酸肽具有独特的富集选择性和分析灵敏度。Gong等[14]采用尖端直径为1 μm、表面氧化的钨丝作为探针，直接对洋葱单细胞中的代谢物(如果聚糖、脂类、黄酮衍生物等)进行富集，然后将溶剂加载在钨丝尖端对代谢物进行洗脱和质谱分析。相比于传统方法先将富集化合物从探针尖端洗脱下来再进行质谱分析，该方法的灵敏度提升了30倍。金属探针因其独特的机械强度和尺寸可调变性，再经表面修饰后不仅适用于常量样品中目标化合物的富集，同时也在微量/痕量样品(如单细胞)分析方面发挥了重要作用。随着该技术的进一步发展，探针式固相微萃取将会在复杂生物体系代谢组学、生理功能等研究方面起到关键作用。

图1 探针式固相微萃取用于采样和质谱分析过程示意图Fig.1 Schematic diagram of probe-based SPME for sampling targets and mass spectrometric analysis

除金属材质可作为探针外，纤维、牙签等也可作为探针用于复杂样品基质中目标化合物的富集。Yang等[15]利用C18修饰纤维选择性富集尿样中5种羟基化多环芳烃，并在纳升毛细管中解吸、电离和质谱分析，方法的线性范围为0.1～5.0 ng·L-1，检出限低于0.05 ng·L-1，回收率可达85.3%～95.3%。Wang等[16]将SPME与热解吸电喷雾电离(Thermal desorption electrospray ionization,TDESI)相结合，考察了聚丙烯酸酯涂覆纤维对水中双酚A的富集效果，检出限低于1 ng·mL-1；同时发现在萃取过程中，纤维探针的数量越多，目标化合物的富集效率越高。Wu等[17]将C18键合SPME纤维与医用棉签相结合，富集口腔、鼻腔及皮肤表面的环境污染物和药物，随后将其插入纳升毛细管进行解吸和质谱分析，检出限可达1.0 pg·mL-1。Mirabelli和Zenobi[18]以PDMS纤维为固相微萃取相，与大气压光电离(Atmospheric pressure photo ionization,APPI)相结合，用于分析极性或非极性的农残、药物和多环芳烃化合物，灵敏度可达pg·mL-1，分析时间小于2 min。Hu等[19]采用C18、NH2、SO3H等官能团修饰的牙签作为探针，富集和分析芥子酸胆碱、甘氨酸-甘氨酸-组氨酸-丙氨酸(Gly-Gly-His-Ala)、丙氨酸、天冬氨酸等目标化合物。但纤维、牙签等材质由于自身的强度或尺寸限制，目前在痕量样品的分析方面应用较少。

2 管内富集式固相微萃取

管内富集式固相微萃取(In-tube enrichment based SPME)早期主要用于色谱分析前复杂样品中目标化合物的分离富集[20-21]。该技术是采用键合固定相、吸附剂、纤维、整体柱材料等对石英毛细管内壁进行修饰或填充，然后利用毛细管内固定相或吸附剂富集样品中待测化合物。目前管内富集式SPME除了与色谱等技术联用外，许多研究也将其与常压电离源(如nanoESI、DART等)相结合，用于目标化合物的快速质谱分析(图2)。Chang等[22]将气相色谱毛细管与注射器相结合，利用毛细管内壁涂层材料的吸附性能富集母乳中有机碘化物，再经溶剂洗脱到纳升毛细管中进行质谱分析，整个分析过程仅需8 min，消耗样品体积为50 μL。Wang等[23]将聚合物甲基丙烯酸-乙二醇二甲基丙烯酸酯-单壁碳纳米管(MAA-EDMA-SWNT)整体柱与注射器相结合，利用整体柱中固相材料富集水样中6种三嗪类除草剂，随后采用DART电离源对整体柱富集的化合物进行电离质谱分析，检出限可达0.06～0.46 ng·mL-1，回收率为85.0%～106%，相对标准偏差(RSD)为3.1%～11%。虽然管内富集式SPME可利用柱管内吸附剂或修饰固定相对目标化合物进行富集，但其最大缺陷是不能对复杂样品(如血样等)直接进行萃取，否则会导致柱管堵塞；另一个缺陷是富集化合物柱管内的洗脱速度受控于注射器，实现自动化操作较为繁琐。

图2 管内富集式固相微萃取用于采样和质谱分析过程示意图Fig.2 Schematic diagram of in-tube enrichment based SPME for sampling targets and mass spectrometric analysis

3 叶片式固相微萃取

叶片式固相微萃取(Blade-based SPME)是2014年Gómez-Ríos和Pawliszyn等[24-25]提出的一种样品富集模式，该技术首先将有机聚合物(如C18-聚丙烯腈)涂覆在含有三角形尖端的不锈钢薄片上，样品分析前先采用适当溶剂(如甲醇-水)对含有聚合物涂层的不锈钢薄片预处理，接着在涡流振荡的条件下，将其放入样品溶液中对目标化合物进行富集，随后用水溶液洗去不锈钢薄片表面吸附的干扰物，最后加载喷雾溶剂进行电离质谱分析(如图3)。相比探针式固相萃取，叶片式固相微萃取由于吸附剂与样品接触面积更大，所以富集效率更高，同时可进行原位样品解吸、电离。为了实现高通量分析，该研究小组将叶片式固相微萃取制成96孔平板，可同时对96个样品进行富集处理，每个样品的分析时间小于55 s，准确度大于90%,精密度为2.5%左右，浓度动力学范围线性系数(r2)大于0.99，复杂生物样品中目标化合物的检出限为0.1～10 ng·mL-1[26]。现今，该方法已应用于不同复杂样品如血浆、血清、尿样、生物组织等中化合物的快速质谱分析[27-30]。叶片式固相微萃取集样品采集与原位解吸电离于一体，可快速实现目标化合物的富集与质谱分析，已实现了96个样品的同时萃取富集，为实现批量样品的自动化操作奠定了坚实的基础。

图3 叶片式固相微萃取用于采样和质谱分析过程示意图Fig.3 Schematic diagram of blade-based SPME for sampling targets and mass spectrometric analysis

4 网格式固相微萃取

网格式固相微萃取(Mesh-based SPME)源于Chipuk和Brodbelt[31]提出的传输模式解吸电喷雾电离源(Transmission mode desorption electrospray ionization,TMDESI)研究，最初为简化解吸电喷雾电离源的结构，他们首先将液体样品滴加在不同材质的网格上，然后采用电喷雾电离源对网格上的化合物进行解吸电离和质谱分析。研究发现随着网格材质的变化，罗丹明6G的信号呈现出聚丙烯>聚醚醚酮(PEEK) >尼龙>涤纶>不锈钢的变化趋势，同时也发现该方法不适合未经处理样品的分析。随后，Jones和Fernández[32]将不锈钢网格与DART电离源联用，用于人血清代谢指纹谱图的研究。为了提高不锈钢网格对复杂样品中目标化合物的分析性能，Gómez-Ríos和Pawliszyn[33]首先采用C18-聚丙烯腈材料对不锈钢网格进行修饰，然后利用修饰后的网格作为固相微萃取固定相富集复杂样品中的目标化合物，再进行DART电离源解吸和质谱分析(如图4)，结果表明复杂基质(如磷酸盐缓冲液)中目标化合物的检出限可达pg·mL-1级。同时比较了网格式SPME与传统SPME纤维(Fibre)、薄膜结构(Thin-film configuration)SPME和柱管结构(In-tube configuration)SPME的性能，发现传统SPME纤维需在样品分析前仔细调整纤维与进样口间的距离，以防DART气流吹扫引起纤维的振动，造成样品解吸、电离分析结果的不重复[34]；对于薄膜结构SPME，由于表面涂层的致密性，无法使DART电离源气流有效通过薄膜，进而影响样品的解吸与电离；柱管结构SPME不仅操作繁琐，需注射泵来控制解吸溶剂的流速，同时样品富集前需对样品离心、过滤，以防样品基质材料、颗粒、纤维或蛋白等堵塞管道[23]；而采用网格式SPME可有效避免上述缺陷。由于PEEK材料具有良好的生物兼容性、不与各种溶剂反应、耐受高温达350 ℃等优点，Vasiljevic等[35]将其涂覆在金属网格表层，然后对复杂生物基体(如唾液和尿样)中的禁用药物进行富集和质谱分析，检出限可达0.5 ng·mL-1，在0.5～200 ng·mL-1质量浓度范围内线性系数大于0.99，回收率为80%～120%。网格式固相微萃取是一种与气流吹扫式常压电离源有效结合的样品富集方式，其性能与叶片式固相微萃取相似，是一种非常具有前景的复杂样品富集技术。

图4 网格式固相微萃取用于采样和质谱分析过程示意图Fig.4 Schematic diagram of mesh-based SPME for sampling targets and mass spectrometric analysis

5 表面涂层式固相微萃取

表面涂层式固相微萃取(Surface coating-based SPME)是将有机聚合物材料涂覆在金属片或铝箔上，然后进行固相微萃取和电喷雾电离的一种方式。Tian等[36]基于分子印迹对目标化合物独特的识别能力，首先采用正硅酸乙酯和3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷对不锈钢等腰三角形金属片进行修饰，然后利用原位共聚的方法将分子印迹聚合在金属片表面，接着将制备好的分子印迹金属片放入牛奶萃取液中对氟喹诺酮抗生素(如恩诺沙星、氧氟沙星、环丙沙星、诺氟沙星和培氟沙星等)进行富集和质谱分析(如图5A)，检出限可达0.1～2 ng·mL-1，回收率为78.8%～103%，RSD为4.5%～11%。So等[37]基于铝箔胶带表面胶的粘着性，将TiO2、C4、C8和C18等材料利用物理涂抹的方法涂覆在铝箔胶带的表面，以其为SPME固定相富集复杂生物基质中的溶菌酶、短杆菌肽D、β-D-吡喃葡萄糖苷和磷酸化肽，以及尿液中羟基多环芳烃化合物，随后进行原位质谱分析(如图5B)，发现该方法对生物基质中目标化合物具有很好的富集和分析效果。表面涂层式固相微萃取最大的优势是可通过改变涂覆材料性能来实现目标化合物的选择性富集，这为复杂样品中特定化合物的高灵敏分析提供了有效途径。该技术今后发展的一个主要研究方向是发展新型、具有高效选择性的分离富集材料。

图5 表面涂层式固相微萃取用于采样和质谱分析过程示意图Fig.5 Schematic diagram of surface coating-based SPME for sampling targets and mass spectrometric analysisA:coated with molecularly imprinted polymer(分子印迹聚合物涂层);B:coated with adsorption materials(吸附材料层)

6 滤膜/滤纸分离式固相微萃取

为了克服复杂生物样品分析过程中小分子和金属盐对待测生物大分子分析的干扰，Zhang等[38]基于纸喷雾电离源，提出了一种膜分离富集方式，该方式先将复杂的生物样品加载在多孔滤膜的表面，再利用溶剂将样品中的小分子和金属盐洗脱到底层的滤纸表面，最后加载喷雾溶剂于滤膜表面，使保留在滤膜表层的待测生物大分子得以高效电离分析(图6)。采用这种方式，NaCl含量为1%～5%的细胞色素C的分析灵敏度提高了10～20 倍，检出限相比于纳升电喷雾电离源提升了10倍。为进一步提高分析性能，该研究小组将微渗析膜与抗体相结合，用于尿样中细胞色素C的富集，发现相比于50 μg·mL-1纳升电喷雾电离源的分析性能，采用这种膜富集方式的喷雾电离分析灵敏度提升了500倍，线性范围介于10～1 250 ng·mL-1。该滤膜分离式SPME技术为生物复杂样品的选择性分离富集提供了新思路。

图6 滤膜分离式固相微萃取用于采样和质谱分析过程示意图Fig.6 Schematic diagram of filter membrane separation-based SPME for sampling targets and mass spectrometric analysis

吸附剂材料由于具有独特的表面性能，在分离分析方面发挥了重要作用。为了将吸附剂独特的分离选择性与常压电离源(如纸喷雾电离源)相结合，本课题组最近发展了一种具有操作简单、涂层可控的真空抽滤涂覆法[39]，采用该方法可将不同固体吸附剂(如金属氧化物[40]、二氧化硅[41]、聚苯乙烯[42]等)涂覆在滤纸表面。通过对不同复杂生物样品(如尿样、血样等)中药物化合物在涂覆滤纸表面扩散行为的考察，发现药物化合物更易富集在涂覆吸附剂的表面，而生物基质(如血样)更易扩散到吸附剂的底端，这为复杂样品中目标化合物的原位选择性分离富集提供了有效策略。例如，采用ZrO2涂覆纸作为纸喷雾电离源基质时，其分析灵敏度相比于未经涂覆的滤纸提高了43～189倍；相比于商品SG81滤纸和二氧化硅单面涂覆滤纸，其分析灵敏度提高了1.5～16.5倍[40]。当利用聚苯乙烯涂覆的滤纸作为纸喷雾电离源基质时，其检出限可达0.004～0.084 ng·mL-1；同时发现聚苯乙烯材料的物理化学性质对纸喷雾过程中目标化合物的洗脱性能影响较大，聚苯乙烯的吸附性能越强，药物化合物在其表面越容易解吸，进而促进了质谱对药物化合物的高灵敏度分析[42]。以上研究表明，发展新型、高效的分离富集材料对于提高纸喷雾电离源在复杂生物样品分析的性能方面起到了关键作用。

7 结论与展望

随着分析技术的快速发展，人们对复杂样品中目标化合物的分析提出了更高要求，固相微萃取-直接质谱分析技术不仅可从复杂样品中萃取富集待测目标化合物，同时具有操作简单、分析效率高等特点，现已在生物学、药物化学、环境化学等领域发挥着重要作用。尽管如此，随着新型固相微萃取材料和质谱电离源技术的逐步演变，该技术仍然存在如下挑战：(1)微量/痕量样品的高灵敏度分析。生命科学中的许多探索性研究均基于微量/痕量样品(如单细胞或生理液体)的分析，但该过程不仅存在样品量少、分析化合物浓度低的问题，同时样品基质极其复杂，为此发展选择性好、富集效率高的固相微萃取材料显得格外重要；(2)缩短分析时间。对于单个样品，目前相关技术的整个分析过程所需时间基本上大于2 min，不利于大量样品的高通量分析，为此进一步简化分析流程，提高样品富集效率是今后的主要研究方向；(3)自动化操作。实现批量样品的快速分析不仅可有效避免人为因素对分析结果的影响，也可提高分析效率，为此发展自动化的固相微萃取串联质谱装置，可极大地拓展该技术在不同领域的广泛应用；(4)现场、原位分析。该技术现今仍局限于将待测样品带回到实验室进行分析，不能实时反映样品中待测化合物的实际情况，为此发展便携式固相微萃取装置与微型化质谱仪是今后的一个重要研究方向。固相微萃取-直接质谱分析技术基于自身的直接、方便、快捷等特点，以上问题的逐步解决将有助于其飞跃式发展。