巨噬细胞对马尔尼菲篮状菌免疫作用机制研究进展

2021-02-26夏露蓝秀万温波

中国真菌学杂志 2021年1期

夏露蓝秀万温波

(1.广西医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室，南宁 530021；2.锦州医科大学附属第一医院，锦州 121000)

马尔尼菲篮状菌(Talaromycesmarneffei)，旧称为马尔尼菲青霉菌(Penicilliummarneffei)，流行于东南亚和中国南部。法国Capponi等[1]在1956年从竹鼠体内分离的青霉菌属温控双相条件致病菌，室温25 ℃条件下表现为菌丝相, 37 ℃环境下表现为酵母相,酵母相菌体具有致病性。马尔尼菲篮状菌病主要集中于免疫力低下人群，尤其HIV患者，若得不到有效的治疗，病死率极高[2，3]。近年来，感染T.marneffei发病率上升趋势明显[4]，其传播途径最常见是经呼吸道吸入T.marneffei孢子导致感染。T.marneffei属胞内寄生真菌，其宿主细胞主要为巨噬细胞，易侵犯免疫系统受损患者的单核-巨噬细胞系统，但机体对其免疫机制尚不明确。本文就巨噬细胞对T.marneffei的识别机制，巨噬细胞抗T.marneffei机制及T.marneffei在巨噬细胞内的存活机制进行总结如下。

1 巨噬细胞识别T.marneffei机制

巨噬细胞为宿主抗T.marneffei感染的免疫防御第一线。T.marneffei作为一种胞内病原体，能否被巨噬细胞识别是其感染宿主的首要条件，也是其致病关键及宿主启动免疫反应的前提。天然免疫细胞在其细胞表面上表达多种模式识别受体(PRR)，例如Toll样受体(TLR)、C型凝集素受体(CLRs)、甘露糖受体、及补体受体(CR)。这些PRR通过结合高度保守的病原体相关分子模式(PAMP)如β-葡聚糖，甘露聚糖和脂多糖来识别病原体，进而启动激活信号转导途径，并诱导某些免疫分子的表达[5]。Yuttana等[6]通过实验证明人单核巨噬细胞上的模式识别受体参与了巨噬细胞对T.marneffei孢子的最初识别,且和细胞因子产生有关。巨噬细胞识别T.marneffei主要有3种重要模式。

1.1 补体受体3 (CR3)

CR3 (Mac-1,αMβ2,CD11b/CD18)是一种有助于识别真菌的高度多能的固有免疫模式识别受体，主要表达于巨噬细胞、成熟中性粒细胞、单核细胞和NK细胞[7]。CR3受体功能较复杂，其在与不同的配体接合所转导信号差异明显[8，9]。CR3的激活由构象变化介导，并由内向外和外向内信号调节[10]。激活CR3内向外信号可以由其他受体启动，如TLR和Dectin-1[11，12]。同时，CR3还参与引发外向信号，具有激活先天免疫效应功能，例如吞噬作用，细胞毒性作用及细胞因子的产生。其能通过一系列信号转导和肌动蛋白重排激活吞噬细胞,促进吞噬细胞黏附、迁移并介导对该病原菌的吞噬[13]。Yong等[14]通过 CR3介导吞噬T.marneffei实验中发现，巨噬细胞在没有调理素存在的条件下也能吞噬T.marneffei并能导致呼吸爆发，在存在调理素的条件下，T.marneffei才能刺激巨噬细胞分泌TNF-α等细胞因子。有研究表明CR3是巨噬细胞吞噬完整的T.marneffei分生孢子最重要的模式识别受体[15]。

1.2 Toll样受体(TLR)

Toll样受体(Toll-like receptors, TLR)属于I型跨膜受体，其含有马蹄形配体结合结构域(LBD)和通过跨膜区连接的信号传导尾。信号结构域与白细胞介素-1受体(IL-1R)具有结构同源性，后被称为Toll / IL-1受体(TIR)结构域[16，17]。TLR既能直接参与非特异性免疫也能连接非特异性与特异性免疫。当微生物突破机体的皮肤、黏膜等物理屏障时，TLR可以识别它们并激活机体产生细胞免疫应答。在机体抵抗T.marneffei侵袭时，巨噬细胞上模式识别受体TLR-2、TLR-4 及Dectin-1表达上调,并被激活产生TNF-α。TLR-4能识别真菌胞壁上的氧联甘露聚糖残基,及TLR-2与Dectin-1可协同识别胞壁上的β-1-3连接的葡聚糖[18-19]。推测TLR-2、TLR-4和Dectin-1这3个模式识别受体可能共同参与了巨噬细胞对T.marneffei的识别、吞噬及杀菌过程[20，21]，且这些受体反应所产生的细胞因子可调节Th0细胞向Th1细胞分化[22]，从而加强细胞免疫过程，杀伤病原真菌。同时，巨噬细胞TLR9也参与对T.marneffei分生孢子的吞噬过程[23]。

1.3 相关性C型植物血凝素1(Dectin-1)

Dectin-1是一种Ⅱ型跨膜蛋白，为β-葡聚糖的功能性受体，广泛存在于树突状细胞、淋巴细胞、巨噬细胞等免疫细胞中。Dectin-1的细胞质尾部含有基于免疫受体酪氨酸活化样基序区域(ITAM)。与Dectin-1的细胞外结构域连接后，细胞质ITAM基序内的酪氨酸残基被磷酸化，使得脾酪氨酸激酶(Syk)募集，最终导致活性氧(ROS)的产生，NF-κB的活化和促炎细胞因子(TNF-α、IL-6 、IL-2等)的诱导[24]，参与调节抗真菌免疫反应[25-26]。Dectin-1可特异性识别β-1,3-葡聚糖和β-1,6-葡聚糖,甚至整个酵母颗粒。可溶性β-1,3-葡聚糖和β-1,6-葡聚糖作用于巨噬细胞,能使TLR-2、Dectin-1的表达上调[21]。

巨噬细胞的识别、吞噬过程复杂，需要通过多种受体及多种细胞因子共同协作完成。研究发现CR3可能与CD16、CD14、甘露糖受体、TLR2以及Dectin-1协同作用，识别病原体并刺激细胞因子产生[27]。

2 巨噬细胞的抗T.marneffei机制

T.marneffei通过细胞外信号调节激酶(ERK)丝裂原活化蛋白激酶依赖性机制诱导TNF-α产生是人体巨噬细胞抗T.marneffei的另一重要宿主防御机制。丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)是由p42和p44胞外信号调节激酶1和2(ERK1/2)，p46和p54c-Jun-NH2-末端激酶和p38 MAP激酶组成的蛋白激酶家族。MAPK是高度保守的丝-苏氨酸激酶，并能被不同的上游MAPK激酶通过它们的双磷酸化作用激活。MAPK级联信号系统涉及到T.marneffei发病机制。在感染T.marneffei期间，MAPKs被激活，并能引起巨噬细胞产生高水平TNF-α。MAPK上游的Ca2+/钙调蛋白/Ca2+-钙调蛋白依赖性蛋白激酶(Ca2+/CaM/CaMK)途径在调节巨噬细胞免疫反应中发挥着重要作用并且能激活涉及免疫调节的多种转录因子。CaM/CaMK途径能否被激活主要依赖于胞内Ca2+的浓度，胞质中Ca2+与CaM结合，CaM反过来激活下游激酶如CaMKII。最近研究表明，在T.marneffei感染巨噬细胞期间，T.marneffei能诱导人体巨噬细胞内[Ca2+] 浓度的增加及Ca2+调节CaM/CaMK通路。Ca2+/钙调蛋白/钙调蛋白激酶Ⅱ途径在调节ERK活化和巨噬细胞中TNF-α的分泌中发挥重要的调节作用[31]。

3 T.marneffei在巨噬细胞内的存活机制

T.marneffei的致病性主要取决于其在杀灭过程中存活并在巨噬细胞内复制的能力。巨噬细胞吞噬体内的主要应激是热、氧化物质和营养缺乏。T.marneffei在胞内存活须应对胁迫压力，其中涉及到应激反应有关的因素，这些包括MAP信号转导级联中的分子、热休克蛋白、抗氧化酶和负责营养物检索的酶[32]。迄今为止研究的T.marneffei应激反应分子机制如下所述。

3.1 T.marneffei对氧化应激反应的调节

真菌通常使用两种控制机制来应对氧化应激：转录因子的核定位和磷酸化的信号转导[33]。在核定位的情况下，应激可以导致转录因子从细胞质转移到细胞核，随后导致参与氧化应激反应的基因的表达增加。在氧化应激中起作用的一种真菌转录因子是Yap1及其直向同源物。Yap1是含有酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)蛋白碱性亮氨酸拉链。在非应激条件下，细胞质Yap1通过其在氨基末端的核定位信号与输入蛋白(Imp)相互作用并被递送至细胞核。在细胞核内，Yap1与Imp解离并通过羧基末端的核输出信号与输出蛋白(Crm1)和GTP负载的Gsp1结合并输出到细胞质中。在氧化应激条件下，Yap1分子的羧基末端富含半胱氨酸的结构域被修饰。这种修饰导致核输出信号的隔离并允许Yap1在细胞核内积累。 Yap1的核积累导致靶基因表达的增加，例如硫氧还蛋白(trx2)、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(gsh1)和谷胱甘肽还原酶(glr1)，它们对H2O2耐受性至关重要[34]。yapA(yap1同源物)最近已在T.marneffei中得到验证。缺失yapA菌株对氧化和亚硝化应激敏感。与野生型和补体株相比，该突变体在人巨噬细胞系内的存活率降低[35]。因此，yapA似乎在T.marneffei的应激反应中起作用。

关于涉及信号转导系统的应激反应机制，真核生物中用于响应环境刺激的保守途径之一包括MAPK级联反应。MAPK途径的高度保守结构由3种通过磷酸化转移信号的激酶组成。通过细胞信号，MAP激酶激酶激酶(MAPKKK)被磷酸化并刺激MAP激酶激酶(MAPKK)的磷酸化。磷酸化MAPKK引起苏氨酸和酪氨酸保守残基上MAP激酶(MAPK)的磷酸化。磷酸化后，MAPK能够磷酸化其底物，包括转录因子和细胞蛋白响应刺激。 MAPK途径在应对多种形式的应激(例如氧化应激、热休克、渗透和营养饥饿)中起作用，被称为应激活化蛋白激酶(SAPK)。在T.marneffei中已经研究了sakA和atfA基因[36，37]。此外，sakA还参与多种细胞活动，包括酵母形态发生，孢子形成和红色素形成。sakA和atfA基因缺失均导致人巨噬细胞系内分生孢子存活率降低，表明它们可能在保护分生孢子免受巨噬细胞杀伤方面发挥作用。在压力条件下，T.marneffei的SakA和AtfA起相互作用。近期有研究表明，SskA(酿酒酵母中的Ssk1p同源物)反应调节因子是SakA磷酸化所必需的[38]。

将环境和蜂窝信号传输到SAPK级联的系统称为双组件信号系统。在真核生物中，传感器组氨酸激酶通常是一种跨膜蛋白，在单一多肽链中含有组氨酸激酶结构域和接受结构域[39]。首先将磷酸基团从激酶结构域中的组氨酸残基转移至接收结构域中的天冬氨酸残基。随后将磷酸转移至含有组氨酸的磷酸转移(Hpt)蛋白上的组氨酸残基和第二反应调节剂分子中的天冬氨酸残基。真核生物中最佳表征的磷酸化系统是Sln1通路，它将信号传递给Hog1级联。该通路由Sln1传感器激酶，Ypd1磷酸转移蛋白和Ssk1反应调节剂组成。在压力条件下，Sln1-Ypd1-Ssk1磷酸化系统将信号传输至Hog1通路。在T.marneffei中已鉴定出Sln1和Drk1的同源物，并分别表示为SlnA和DrkA。SlnA和DrkA是渗透压力适应所必需的，且在渗透和细胞壁应激期间参与MAP激酶、SakA和MpkA的磷酸化。此外，SlnA和DrkA也分别与巨噬细胞感染期间的分生孢子萌发和二态转换有关[40]。另一种是Skn7反应调节剂，它是可以从Ypd1磷酸转移蛋白中接受磷酸基团的蛋白质。与Ssk1不同，Skn7含有DNA结合结构域并起转录因子的作用。在通过Ypd1磷酸化后，Skn7易位至细胞核且独立于Hog1途径调节抗氧化基因的表达。T.marneffei的skn7基因能够在酿酒酵母中功能性地取代Skn7，这表明它在这种二态真菌中具有氧化应激反应的作用。

3.2 与吞噬体模拟应激反应相关蛋白

抗氧化蛋白吞噬体氧化应激通常涉及ROS和RNS的作用。与其他致病真菌的致死浓度相比，T.marneffei对H2O2抵抗力相对较低。因此猜测T.marneffei在吞噬体环境中存活的能力应归因于几种未知因素的组合而不仅仅是氧化剂抗性能力，例如真菌抑制吞噬体和溶酶体融合的能力。有研究发现，T.marneffei拥有1种有效且足够的系统来应对巨噬细胞的吞噬体环境，其中包括两种编码抗氧化蛋白的基因：氧化物歧化酶(sodA)和过氧化氢酶-过氧化物酶(cpeA)。cpeA参与T.marneffei的致病性及在抗吞噬杀伤中发挥作用。另一种重要的抗氧化分子是黑色素。据报道，黑色素对真菌病原体中的氧化和其他类型的细胞壁应激具有保护作用。

热响应蛋白病原体的典型毒力因子之一是耐受人体温度的能力。T.marneffei是一种二形双相真菌，通过启动酵母形态发生来响应人体温度，酵母形态发生与生物体的毒力紧密相关。热休克蛋白(Hsp)在感染过程中致病真菌的适应过程中起重要作用[41]。T.marneffei分生孢子在37℃能产生大量的抗原性Hsp30和Hsp70 ，以及Hsp60和Hsp90也优先在T.marneffei酵母期中表达。鉴于T.marneffei的温度依赖性二态性质，这些热休克蛋白可能在这种二态真菌的发病机制中起重要作用。

营养饥饿负责蛋白质吞噬体内低浓度葡萄糖使得T.marneffei必须同化其他碳源物质以产生能量，已有研究显示乙醛酸循环在T.marneffei感染期间被诱导，有助于该真菌的毒力提升。该途径以三羧酸循环的乙酰辅酶A作为能源。编码异柠檬酸裂解酶的基因acuD是乙醛酸循环中的关键酶。在T.marneffei的酵母期和巨噬细胞感染过程中，该酶表达增加，也从酵母相cDNA文库中分离出编码重要糖原异生酶的基因，包括果糖-1,6-二磷酸酶。这些基因在酵母形态发生过程中高度表达[42]。此外，酪氨酸通过糖异生途径促进碳的获得[43]。酪氨酸可以变成富马酸和乙酰乙酸，然后分解成乙酰辅酶A，这是三羧酸循环的底物，用于产生能量。除了营养供应之外，酪氨酸分解代谢产物可用于产生黑色素。如上所述，T.marneffei产生的黑色素分子在致病性中发挥作用[44]。T.marneffei响应增加糖异生的活性，降低了使用葡萄糖作为底物的糖酵解活性。在巨噬细胞感染期间，糖酵解酶甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gpdA)的表达降低。这些研究结果表明，T.marneffei对葡萄糖缺乏做出反应，并通过减少糖酵解和乙醛酸循环途径和糖异生的诱导来补偿能量产生。另外，微量营养素铁对T.marneffei的生长和致病性也很重要。铁过载增强了T.marneffei的细胞内和细胞外生长，相反，吞噬体内铁的缺乏能抑制该真菌的生长。

T.marneffei的发病机制成功归因于该真菌在宿主巨噬细胞内适应和存活的能力。在宿主免疫细胞内停留和繁殖是这种兼性细胞内病原体逃避适应性免疫应答的极好的存活策略。与许多其他兼性细胞内病原体一样，T.marneffei使用抗氧化性、热休克蛋白和保守的MAPK信号级联来响应宿主细胞环境带来的应激。已证实过氧化氢酶-过氧化物酶参与该真菌的毒力，且编码该酶的基因的缺失突变体减弱了巨噬细胞感染模型中的毒力。然而，在T.marneffei中没有很好地描述细胞内存活机制。