142例支气管肺泡灌洗液真菌免疫荧光染色检测结果与G/GM试验结果对比分析

李刚荣 白明明 陶朝欣 杨会涛 许丽亚

(1.河北省强制隔离戒毒所医院检验科，石家庄 050081；2.石家庄荣瑷医学检验所检验科，石家庄 050021)

近年来，随着人口老龄化及抗生素的广泛使用，肺部真菌感染呈升高趋势，当机体免疫功能低下时可引发肺部真菌感染[1]，真菌感染后的早期诊断及时治疗对降低患者死亡率至关重要。真菌的检测手段一直以来是临床最为迫切的需求，血浆(1,3)-β-D葡聚糖(BG)试验(G试验，Glucan test)和半乳甘露聚糖抗原检测试验(GM试验,Galactomannan test)的发展和推广，为临床提供了快速有效的检测方法。支气管肺泡灌洗液(brondioalveolar lavage fluid，BALF)的G/GM试验在用于肺部真菌感染的诊断方面逐年推广，相较于传统的检测方法，该方法具有快速高效、灵敏度和特异性较高的优势，因而被广泛运用于临床[2]。

真菌免疫荧光染色检测是近年来新发展的一种染色技术，染色液中的荧光增白剂是一种荧光染料，与多种植物以及真菌细胞壁的几丁质和纤维素具有较强的亲和力，在特定的紫外光下(350～400 nm)，能够发出亮蓝色荧光，通过荧光显微镜观察其形态，可达到检测出真菌的目的。我们对142例BALF进行G试验和GM试验检测，同时进行免疫荧光染色法和氢氧化钾(KOH)湿片法镜检作对比，以期为肺部真菌感染提供更便捷高效的早期联合检测方法。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选择2019年1月至12月送检至本所的BALF真菌检测G试验/GM试验142例，其中男性94例，女性48例，年龄14～86岁，中位年龄55.5岁，临床初步诊断分别为慢性阻塞性肺部疾病(COPD)59例，重症肺炎21例，真菌性肺炎24例，肺部感染待查38例。所有送检的BALF在G/GM试验的同时进行免疫荧光染色检测和KOH湿片法镜检，并根据检测结果进行分析。

1.2 标本采集

所有BALF均为支气管镜下采集，方法如下：患者无纤支镜禁忌证，应用2%利多卡因为患者进行局部麻醉，待麻醉生效后，经鼻腔置入纤支镜，向可疑肺病变部位进行灌洗，灌洗液为灭菌氯化钠注射液，每次30～50 mL，连续灌洗3～4次后，采用负压吸引下对灌洗液进行回收，收集灌洗液10～15 mL进行送检。

1.3 检测试剂

真菌免疫荧光显色试剂II型购自珠海贝索生物技术有限公司，10%KOH溶液为本室自制。显微镜采用奥林巴斯CX31光学显微镜和荧光模块(MF-UV-LED-0-3型)。G试验试剂盒为真菌葡聚糖检测试剂盒(动态浊度法)，购自厦门鲎试剂生物科技股份有限公司，Platelia TM曲霉菌抗原检测试剂盒购自美国伯乐公司。所有实验步骤均按本室SOP操作。

1.4 检验方法

BALFG试验和GM试验 低温保存并无菌送检的BALF经离心处理后，采集上清液进行G、GM试验。BALF G试验采用动态浊度法，应用TALgent动态检测系统，检测结果以其浓度值大于20 pg/mL作为阳性判定标准。GM试验运用酶联免疫双抗体夹心一步法，对每个受检标本计算指数I，BALF的GM试验以待测标本的指数I≥0.5作为阳性判定标准。

真菌免疫荧光染色 按试剂盒操作说明书进行，取待测BALF标本离心2000 g/10 min，弃上清液并充分混合沉淀物，以无菌吸管吸取标本，取一滴均匀涂至洁净载玻片上，分别滴加荧光染色液A液和B液各1滴，覆上盖玻片，静置1 min后镜检。结果判读：真菌的菌丝及孢子均呈亮蓝色，结构清晰明显，其他细菌和组织呈弱蓝色荧光，背景为蓝黑色，阳性报告为标本经荧光染色可见有隔的真菌菌丝和卵圆形真菌孢子，阴性报告为未找到真菌菌丝和孢子。

KOH湿片直接镜检 标本同免疫荧光染色处理后滴加1滴10%KOH溶液，盖上盖玻片，酒精灯火焰上微加热后，轻压盖玻片，使标本透明，显微镜下直接观察。

1.5 统计学分析

应用SPSS17.0分析软件进行处理，所得计量资料数据采用均数标准差表示，两组间采用独立样本t检验的方法，计数资料采用卡方检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 BALF真菌直接镜检两种方法检测结果比较

142例BALF标本中免疫荧光染色检测阳性52例，阴性90例，阳性率为36.62%；KOH湿片直接镜检检测阳性27例，阴性115例，阳性率19.01%，两者差异有统计学意义(2=45.003，P<0.001)，见表1。

表1 BALF真菌免疫荧光染色检测与KOH湿片法直接镜检检测结果比较Tab.1 Comparison between the results of fluorescent staining of BALF fungi and the results of direct microscopic examination by KOH

2.2 BALF G/GM试验检测结果

以BG浓度高于20 pg/mL作为阳性，G试验检测出阳性例数为89例(占62.68%)。同时以单次I值大于0.5为阳性，GM试验阳性例数为23例(占16.20%)，见表2。

表2 142例BALF G试验与GM试验检测结果Tab.2 Results of BALF G test and GM test in 142 cases

2.3 BALF G试验与免疫荧光染色联合检测结果

根据真菌免疫荧光染色操作说明书，检出真菌菌丝或孢子者判断为真菌免疫荧光染色检测结果为阳性，52例BALF 真菌免疫荧光染色检测阳性中同时G试验阳性者为49例，GM试验阳性者为11例，见表3。G试验阳性中免疫荧光染色阳性时BALF G试验(BG)浓度与阴性时BG浓度比较，两者差异并无统计学意义(P=0.814)，见表4。

表3 142例BALF G/GM试验与免疫荧光染色检测结果Tab.3 Results of BALF G / GM test and immunofluorescent staining in 142 cases

表4 真菌免疫荧光染色阳性BG浓度结果比较 [例(%)]Tab.4 Comparison of G-test results of fungus fluorescent staining positive BALF [n(%)]

3 讨 论

肺部真菌感染的早期诊断对临床上很多免疫功能低下的老年患者来说是关键因素，而传统的呼吸道痰培养及KOH湿片法镜检检出真菌方法敏感性及特异性均较差。G试验是一种通过显色法对产生(1,3)-β-D葡聚糖的真菌感染进行早期诊断的方法，因普遍存在于真菌细胞壁中，能特异性激活鲎成份中的凝血因子G因子从而激活鲎试验[3]。体液中的BG含量上升是人体感染真菌后的1种现象，检测其水平已成为肺部真菌感染诊断的重要手段。有研究表明BALF(1,3)-β-D葡聚糖浓度峰值出现时间要早于血浆，且具有较高的特异性，有利于早期诊断[4]。GM试验是检测大多数曲霉感染的一种手段，曲霉在体内外生长时都能释放GM抗原。研究表明支气管镜下采集BALF行GM试验联合G试验，对于诊断肺曲霉病优于单独的GM试验、G试验以及血清GM试验联合G试验，而联合检测可以弥补单项检测的不足，具有准确率高、灵敏度高和特异度高等优点，有助于肺曲霉的早期诊断[5]。

免疫荧光染色检测真菌可直接通过荧光显微镜观察真菌形态，镜下菌丝和孢子结构清晰可见(见图1～8)，显微镜下直接检测出菌丝或者孢子对临床深部真菌感染具有直接指导作用。无论浅部真菌还是深部真菌，相较传统的KOH湿片法大大提高了真菌的检出率[6]，同时免疫荧光染色后标本中的菌丝孢子呈现亮蓝色，易分辨，不易漏检和误检，分析显示免疫荧光染色的真菌检出率明显高于KOH湿片法(见表1)。

通过对BALF真菌免疫荧光染色检测结果与G/GM试验的对比分析发现，142例BALF检测G试验阳性共89例，免疫荧光染色阳性为52例，免疫荧光染色与G实验同时阳性者为49例，与GM试验同时阳性者为11例。BALF中G/GM试验的联合检测对于肺部真菌感染的指导价值，已有很多临床研究进行了探讨。BALF真菌免疫荧光染色检测受到真菌在标本中的含量及检验医师的阅片水平等因素的影响，存在一定程度的假阴性率，在试验设定的G试验和GM试验阳性标准下，真菌免疫荧光染色检测的相对假阴性率分别为44.94%和52.17%。BALF G试验阳性时真菌免疫荧光染色阳性与阴性的BG浓度值之间并无显著差异，P=0.814(见表4)，表明在显微镜下未检测出真菌时，通过G试验仍可能检测出高浓度BG，可能与真菌感染局部肺组织后形态被破坏或者标本采集的因素影响有关，这也是导致出现假阴性的原因。同时仍有3例(5.67%)G试验阴性BALF标本中通过免疫荧光染色直接检测出真菌(见表3)，因此，采用多种方法联合检测共同分析肺部真菌感染，避免单一检测方法的假阳性或假阴性是临床诊断工作中的重要方法。

图1-4 BALF真菌免疫荧光染色检测镜下菌丝(10×40) 图5-8 BALF真菌免疫荧光染色检测镜下孢子(10×40)Fig.1-4 Detection of hyphae (10×40) in BALF by immunofluorescent staining Fig.5-8 Detection of spores (10×40) in BALF by immunofluorescent staining

真菌菌丝及孢子经荧光染色后，形态清晰，轮廓分明，易于识别，能提高常规染色和KOH湿片检测真菌的阳性率，对于一些特殊的典型菌体如曲霉、马尔尼菲篮状菌、毛霉、接合菌还可以提供初步的形态学诊断[7]，这是其他快速检测方法所不具备的。因此真菌免疫荧光染色检测作为一种快速方便高效直观的真菌常规检测方法，是BALF标本真菌检测的重要补充，为临床肺部真菌感染的诊断提供了一种快速检测方法。进一步将真菌免疫荧光染色检测技术联合其他检测方法，降低肺部及其他脏器的真菌感染假阴性率是今后的重点研究课题。