慢性阻塞性肺疾病患者血清mir-210、HIF-1α表达水平及意义

蔡燕

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)简称慢阻肺，是一种常见的慢性呼吸系统疾病，主要临床特征为呼吸气流受限[1]、咳嗽、胸闷，其中急性加重期患者若病情控制不当，可能发展为肺功能衰弱，最终导致呼吸衰竭[2]。据报道低氧和气道炎症是COPD疾病的相关影响因素[3]。缺氧诱导因子1α(hxpoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)在低氧状态下的细胞中能够高表达，能够适应机体缺氧，参与缺氧性肺动脉高压、炎性因子的表达等[4]，在COPD疾病发生发展中起到重要推动作用。另有相关文献报道miRNA能通过调节平滑肌细胞中促炎因子释放，导致肺部疾病病情加重[5]。然而有关mir-210和HIF-1α在水平变化对COPD疾病影响研究较少，本文拟探究mir-210、HIF-1α在COPD血清表达情况，并分析其在早期预防COPD的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取本院2016年10月至2018年10月收治的COPD患者88例，其中急性加重期(急性加重期COPD组)43例，男24例，女19例；年龄55～70岁，平均年龄(61.20±9.34)岁；稳定期(稳定期COPD组)45例，男25例，女20例；年龄50～75岁，平均年龄(64.50±6.87)岁。选取本院体检健康者45例，男25例，女20例；年龄48～76岁，平均年龄(65.30±8.64)岁。3组年龄、性别比差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 纳入与排除标准 纳入标准：(1)符合COPD诊治指南(2013年修订版)；(2)1个月内无胸腔及其他手术者；(3)近3个月未注射免疫抑制剂者；(4)自愿参与本临床试验，同意签署临床研究协议书。排除标准：(1)患有肾、肝、心功能障碍患者；(2)患有有关支气管扩张、支气管哮喘、肺部疾病患者；(3)患有其他部位感染患者；(4)有长期激素治疗患者；(5)精神疾病患者。本研究通过本院伦理委员会批准，符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》。

1.3 主要试剂及仪器 人HIF-1α ELISA试剂盒，上海广锐生物科技有限公司；逆转录试剂盒、荧光定量试剂盒，德国Promega公司；RNA提取试剂盒，日本TaKaRa公司；Masterscreen Diffusion型肺功能检测仪，德国JAEGER公司；278型血液气体分析仪；美国康宁；Multiskan Sky全自动酶标仪、PikoReal荧光定量PCR仪，美国赛默飞世尔公司；eppendorf冷冻低速离心，德国Eppendorf公司。

1.4 方法

1.4.1 样本采集:所有受试者入院后或体检当天空腹采集静脉血8 ml，静置10 min，3 000 r/min，4℃，10 cm半径离心20 min。收集上清液。

1.4.2 指标检测:①HIF-1α水平检测：依照人HIF-1α ELISA试剂盒操作步骤采用酶联免疫法检测血清HIF-1α水平。②肺功能检查：用肺功能仪检测用力肺活量(forced vital capacity，FVC)、第1秒用力呼气量占用力肺活量比值(FEV1/FVC)、用力呼气中期流速(maximal mid-expiratory flow curve，MMEF)和呼气峰值流速(peakexpiratoryflow，PEF)。③血气分析：用肝素化注射器抽取所有受试者桡动脉血0.5 ml，用血液气体分析仪进行血气分析。

1.4.3 荧光定量PCR检测血清mir-210的表达水平:用RNA试剂盒提取血清中总RNA，核算蛋白分析仪测定260/280值为1.9～2.0，证明RNA浓度良好。反转录cDNA，保存于-20℃备用。mir-210和内参引物送与上海生工合成。qRT-PCR反应体系20 μl：2×STBR Master Mix 12.5 μl，模板cDNA(50 ng/μl)1 μl，正向引物 1.0 μl，反向引物1.0 μl，ddH2O 4.5 μl。反应条件：95℃，5 min；95℃，20 s；62℃，30 s；72℃，35 s；30个循环。对mir-210相对表达量用2-ΔΔCT法计算。见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

2 结果

2.1 稳定期COPD组和急性加重COPD组血清miR-210表达水平和HIF-1α水平 对照组、稳定期COPD组、急性加重期COPD组患者血清mir-210表达水平和HIF-1α水平，两两比较差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较，稳定期COPD组、急性加重期COPD组患者血清mir-210表达水平显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)，HIF-1α水平显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与稳定期COPD组比较，急性加重期COPD组患者血清mir-210表达水平明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)，HIF-1α水平明显上升，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 COPD患者血清miR-210表达水平和HIF-1α水平比较

2.2 3组血气指标比较 与对照组比较，稳定期COPD组、急性加重期COPD组患者血气指标PaO2显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)，PaCO2显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)，与稳定期COPD组比较，急性加重期COPD组患者血气指标PaO2显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)，PaCO2显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 3组血气指标比较

2.3 2组肺功能FVC、FEV1/FVC、MMEF和PEF指标比较 与对照组比较，稳定期COPD组、急性加重期COPD组患者肺功能指标FVC、FEV1/FVC、MMEF和PEF显著下降，差异有统计学意义(P<0.05)，与稳定期COPD组比较，急性加重期COPD组患者肺功能指标FVC、FEV1/FVC、MMEF和PEF显著下降，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 2组肺功能指标比较

2.4 COPD患者血清miR-210表达水平与HIF-1α水平相关性分析 Pearson相关性分析显示COPD患者血清miR-210表达水平与HIF-1α水平呈负相关(r=-0.648，P<0.05)。见图1。

图1 COPD患者血清miR-210表达水平与HIF-1α水平相关性分析

2.5 COPD患者血清mir-210表达水平、HIF-1α水平与肺功能、血气指标的相关性分析 COPD患者血清mir-210表达水平与FVC、FEV1/FVC、MMEF、PEF、PaO2水平呈正相关(P<0.05)，与PaCO2水平呈负相关(P<0.05)。COPD患者血清HIF-1α水平与FVC、FEV1/FVC、MMEF、PEF、PaO2水平呈负相关(P<0.05)，与PaCO2水平呈正相关(P<0.05)。见表5。

表5 Pearson相关性分析

3 讨论

COPD是一种临床上常见肺部慢性疾病，多以低氧血症为先发征兆[6]。有研究报道炎性反应、氧化应激反应等在COPD发生发展过程中发挥作用，然而COPD发病机制复杂，具体机制不清楚[7]。

据报道COPD患者呼吸功能与炎性因子有关，肺功能指标和血气指标可评价患者呼吸功能，其中FEV1/FVC和PEF可反应气道阻塞的程度[8]，PaO2可反映患者血氧分压。马原等[9]研究发现COPD患者肺功能指标FVC、FEV1/FVC、MMEF、PEF和血气指标PaO2显著降低，PaCO2显著上升。刘林林等[10]研究发现急性加重期COPD患者血气指标PaO2显著下降，PaCO2显著上升。徐继勋等[11]发现COPD患者肺功能指标FVC、FEV1/FVC、MMEF、PEF显著低于对照组。本研究发现，稳定期COPD组和急性加重期COPD组患者FVC、FEV1/FVC、MMEF、PEF和PaO2显著低于对照组，PaCO2显著高于对照组，提示COPD疾病可能对机体呼吸功能有影响，COPD患者均存在一定程度呼吸功能障碍。与稳定期COPD组比较，急性加重期COPD组患者FVC、FEV1/FVC、MMEF、PEF和PaO2显著降低，PaCO2显著升高，提示呼吸功能受损害程度可能与COPD病情进展有关。

虽然肺功能指标能一定程度评估COPD患者病情，但预测患者病情灵敏度具有一定局限性[12]。HIF-1α水平能够反映机体缺氧缺血程度，HIF-1α也能够诱导细胞缺氧环境形成。陶洪臣等[13]研究发现HIF-1α在COPD患者血清中水平显著高于肺功能正常组，推测HIF-1α水平增加与COPD患者肺功能障碍有关。李芳等[6]研究发现，HIF-1α在COPD患者外周血单个核细胞中水平明升高。戈艳蕾等[14]研究发现HIF-1α在COPD患者血清中水平明显高于对照组。本研究发现HIF-1α在稳定期COPD组和急性加重期COPD组患者血清中水平显著高于对照组，提示HIF-1α可能在COPD疾病发展中有一定作用。与稳定期COPD组比较，HIF-1α在急性加重期COPD组患者血清中显著升高，提示HIF-1α可能与COPD病情严重密切相关。进一步Pearson相关分析显示，HIF-1α与FVC、FEV1/FVC、MMEF、PEF和PaO2呈负相关性，与PaCO2呈正相关性。提示血清HIF-1α水平变化可能对COPD患者呼吸功能有重要影响。

研究发现，mir-210与肺炎、哮喘、COPD等各种呼吸系统疾病密切相关[15]。Li等[16]研究发现mir-210在肺癌组患者血浆表达水平显著低于COPD组，猜想mir-210可能与COPD发生发展相关。Wang等[17]研究发现mir-210在老年COPD患者外周血中表达水平显著低于健康对照组。本研究发现mir-210表达水平在稳定期COPD组和急性加重期COPD组患者血清中显著降低，提示mir-210可能在COPD疾病发生具有一定作用。急性加重期COPD组患者血清中mir-210表达水平显著低于稳定期COPD组，提示mir-210表达水平变化可能与疾病严重程度相关。本研究还发现mir-210与FVC、FEV1/FVC、MMEF、PEF和PaO2存在正相关性，与PaCO2存在负相关性，提示COPD患者mir-210表达水平变化可能一定程度上也影响患者呼吸功能。章辉等[18]研究发现在低氧条件下，大鼠气道平滑肌细胞miR-199-5p表达减少，HIF-1α水平增加，推测miR-199-5p可能能抑制低氧条件下HIF-1α水平增加。本文研究发现COPD患者血清mir-210表达水平与HIF-1α存在负相关性，提示mir-210与HIF-1α可能存在相互作用关系，共同参与COPD疾病发生发展。

综上所述，HIF-1α在COPD患者血清中呈高表达，mir-210呈低表达，二者呈负相关，均与肺功能指标及血气指标水平相关，可能与COPD疾病发生发展密切相关。本研究尚待继续探讨mir-210与HIF-1α如何相互作用影响COPD疾病。